雙酶法水解辣椒粕蛋白的工藝研究

趙　靜，王　燕*（湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128）

雙酶法水解辣椒粕蛋白的工藝研究

趙靜，王燕*
（湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128）

以水解度和肽得率為評價指標，研究了復合蛋白酶和風味酶雙向酶解辣椒粕蛋白制備多肽的工藝條件，并在單因素試驗的基礎上采用正交試驗對此工藝進行優化。結果表明，復合蛋白酶和風味酶雙向酶解辣椒粕蛋白制備多肽的最佳工藝條件為：復合蛋白酶/風味酶質量比為2∶1，總酶用量為2%，酶解時間為6 h，酶解pH值為6.5，酶解溫度為50℃。在此最佳條件下進行驗證試驗，測得酶解液的水解度為19.44%，肽得率為6.52%。

辣椒粕；蛋白酶；酶解

紅辣椒經過提取得到辣椒紅色素和辣椒素，其質量只占辣椒總質量的7%～10%，殘余物辣椒粕占質量的90%～93%，辣椒粕中含有蛋白質、糖類、脂肪、維生素及多種礦物質元素，纖維素含量高達23.84%，蛋白質含量可達14%～19%［1］。目前，對辣椒蛋白的研究較少且主要集中在辣椒籽蛋白的研究。胡志輝等［2］對辣椒種子貯藏蛋白質的組成及含量進行了研究。寧娜［3］測定了9中辣椒籽的蛋白質組成，結果表明，氨基酸種類齊全，谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸含量豐富。而在辣椒粕的研究方面，則主要針對飼料添加劑量進行研究，田宗祥等［4］在60～90 kg豬的飼料中添加2.5%去籽辣椒粕，可使屠宰率提高1.60%，同時添加辣椒粕組與未添加辣椒粕空白組對比，可明顯改善豬肉品質，肉香味變濃，增強肌肉的多汁性，提高保水力。趙國群等［5］以辣椒粕水浸提液作為培養基，對4種酵母菌進行發酵培養，篩選出適宜以辣椒粕為原料生產細胞蛋白的優良菌種，為充分利用辣椒粕這一資源奠定基礎。

近年來，全世界對蛋白資源作了較多深入的研究。水解植物蛋白是眾所周知的調味產品。到目前為止，玉米蛋白［6］、花生蛋白［7］、菜籽蛋白［8］、米糠蛋白［9］、豆粕蛋白［10］、南瓜籽粕蛋白［11］等酶解產物中相繼被發現含有獨特生理活性的功能肽抑或是風味增強肽，其中大豆多肽、玉米多肽等成功進行了產業化。但在實際應用中就如何綜合利用辣椒粕蛋白的研究和報道均較少。為了充分利用好這些蛋白質資源，對蛋白質進行水解是十分必要的。植物蛋白水解率一般較動物蛋白低，采用單酶水解較難獲得足夠短肽。復合蛋白酶與風味酶的適宜pH和溫度范圍較為接近，水解位點也具有一定互補性，因此生產和研究中兩者多復配使用。

本研究以實驗室自制的辣椒粕蛋白為底物，以水解度和肽得率為考察指標，研究了復合蛋白酶和風味酶雙向酶解辣椒粕蛋白制備多肽的工藝條件，以期為辣椒粕蛋白的高值化利用提供新的理論依據，同時為實際生產中利用可控酶解技術水解植物蛋白制備鮮味肽奠定了工藝基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

辣椒粕：山東中椒英潮辣業發展有限公司；辣椒粕蛋白為實驗室自制（蛋白質含量約為59.14%）：復合蛋白酶（120 U/mg）、風味酶（200 U/mg）：上海楷洋生物技術有限公司；氫氧化鈉、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、鹽酸、硼砂、甲醛、無水硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、硼酸等化學試劑均為分析純：天津市風船化學試劑科技有限公司；D45 mm透析袋（截留分子質量8 000～14 000 u）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2儀器與設備

FW177型中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AUY220型分析天平：日本島津公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；pHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；KDN-103F型定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；臺式低速離心機TDZ5型離心機：湖南赫西裝備儀器有限公司；GL-3250B磁力攪拌器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FD-1B冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1辣椒粕蛋白制備多肽的工藝流程

辣椒粕→粉碎→過100目篩→超聲輔助堿溶酸沉法提取（料液比1∶20（g∶mL），溫度50℃，時間4 h，超聲功率250 W）→離心分離（3 000 r/min離心15 min）→收集上清液→酸沉（稀鹽酸調節pH至3.6）→離心分離（3 000 r/min離心15 min）→收集沉淀→經透析袋脫鹽（截留分子質量8000～14000u）→冷凍干燥（溫度-50℃，時間10 h）→辣椒粕蛋白→酶解（復合蛋白酶和風味酶水解辣椒粕蛋白）→滅酶（沸水浴中保持5 min）→自然冷卻→離心分離（3 000 r/min離心15 min）→取上清液→辣椒粕蛋白多肽液

1.3.2復配酶雙向酶解的單因素試驗

復合蛋白酶和風味酶比例：總酶用量2%（相對于辣椒粕蛋白的質量），酶解pH 6.5，酶解時間5 h，酶解溫度50℃時，考察復合蛋白酶和風味酶的質量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（g∶g））對辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

總酶用量：復合蛋白酶和風味酶的質量比2∶1，酶解pH值6.5，酶解時間5h，酶解溫度50℃時，考察總酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

酶解時間：復合蛋白酶和風味酶的質量比2∶1，總酶用量2%，酶解pH值6.5，酶解溫度50℃時，考察酶解時間（4h、5h、6 h、7 h、8 h）對辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

酶解pH值：復合蛋白酶和風味酶的質量比2∶1，總酶用量2%，酶解時間5 h，酶解溫度50℃時，考察酶解pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）對辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

酶解溫度：復合蛋白酶和風味酶的質量比2∶1，總酶用量2%，酶解pH值6.5，酶解時間5 h時，考察酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）對辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

1.3.3復配酶雙向酶解的正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，將固液比固定為1∶10（g∶mL），固定總酶用量2%，以水解度和肽得率為評價指標，作復合蛋白酶和風味酶的質量比、酶解時間、酶解pH值、酶解溫度的4因素3水平L9（34）的正交試驗設計，正交試驗因素與水平見表1。

表1　辣椒粕蛋白酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization of hot pepper residues protein

1.3.4辣椒粕蛋白酶解液的水解度及肽得率的測定

水解度是衡量蛋白質水解的重要指標之一，水解度越大，表明蛋白質水解越徹底，游離氨基酸的含量越高［12］。在蛋白酶解過程中，由于酶作用程度的不同導致蛋白質的降解程度不同，從而使得蛋白水解物中氨基酸和肽的含量存在一定的差異。當蛋白酶解產物中氮的存在形態主要是以肽基氮形式存在時，肽得率將提高，酶解液會呈現良好的風味和口感。按照凱氏定氮法測定總氮（total nitrogen，TN）甲醛電位滴定法［13］測定酶解液中游離氨基酸態氮（amino nitrogen，AN）。水解度及肽得率［14］的計算公式如下：

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1復合蛋白酶和風味酶的質量比對辣椒粕蛋白酶解的影響

圖1　復合蛋白酶/風味酶對辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.1 Effect of mass ratio of protamex to flavorzyme on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖1可知，隨著復合蛋白酶所占比例的增加，水解度呈先上升后下降趨勢，肽得率也緩慢升高，當復合蛋白酶和風味酶的質量比為2∶1時，水解度為20.04%，肽得率為6.42%，且均達到最大值。這是因為復合蛋白酶屬于非特異性蛋白質肽鍵內切酶，辣椒粕蛋白在其作用下快速水解，生成游離氨基酸和小分子肽。同時，辣椒粕蛋白經酶解后其疏水性氨基酸殘基暴露出來，得到的酶解液將會帶有明顯苦味；而風味酶是經深層發酵生產的蛋白酶和肽酶的復合物，含有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性，可以有效地將疏水性氨基酸從脯氨酸末端切除，有助于酶解形成良好風味［15］。因此，綜合這兩種酶的作用效果及酶的價格，選擇復合蛋白酶和風味酶的質量比為2∶1。

2.1.2總酶用量對辣椒粕蛋白酶解的影響

圖2　總酶用量對辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.2 Effect of total enzyme addition on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖2可知，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率隨著酶用量的增多先升高后降低。這是由于添加一定量的蛋白酶，其活性位點與底物充分接觸，酶解效果較好，繼續加酶，肽在繼續酶解的過程中將會降解為游離氨基酸，肽得率降低。所以，綜合酶解效果和酶的價格，選擇總酶用量為2%。

2.1.3酶解時間對辣椒粕蛋白酶解的影響

圖3　酶解時間對辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度和肽得率均呈現先上升后下降的趨勢。在水解初期，水解程度快速增加；在酶解時間5 h時，水解度為20.02%，而肽得率達到最大值6.43%；在酶解時間6h時，水解度達到最大值20.50%，肽得率相對較高即為6.39%，之后便顯著降低。這可能是由于在一定時間內，蛋白質得到充分的酶解，且都以小肽形式存在，故肽得率較高；繼續延長酶解時間，酶解液體系內的產物增加到一定濃度，反而對酶的活力產生抑制作用，使肽得率下降［16］。因此確定復配酶雙向酶解時間為5 h。

2.1.4酶解pH值對辣椒粕分離蛋白酶解的影響

圖4　酶解pH值對辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis pH on the hydrolysis of hot pepper residues protein

從圖4可知，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率隨酶解pH值的增大先升高，后降低。當pH值為6.0時，水解度達到最大值21.66%，肽得率較低；當pH值為6.5時，水解度相對較高，肽得率達到最大值6.47%。究其原因，可能是由于中性的復合蛋白酶和風味酶以2∶1復配時，在中性至微酸性條件對辣椒粕蛋白有較好的水解效果。故確定酶解pH值為6.5。

2.1.5酶解溫度對辣椒粕分離蛋白酶解的影響

圖5　酶解溫度對辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖5可知，當酶解溫度在40～50℃時，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率顯著升高；隨著酶解溫度的繼續升高，水解度和肽得率急劇降低。這是因為隨著溫度的升高，酶與底物之間的接觸機會增多，水解度增大，肽得率升高；繼續升高溫度，蛋白酶喪失活性，酶解效果下降［16-17］。因此，選擇復配酶雙向酶解溫度為50℃。

2.2辣椒粕蛋白酶解條件優化的正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，固定總酶用量為2%，以水解度和肽得率為評價指標，考察復合蛋白酶和風味酶的質量比、酶解時間、酶解pH值、酶解溫度對結果的影響。辣椒粕蛋白酶解正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，以水解度為評價指標，影響水解度的因素主次關系是C＞B＞A＞D，即酶解pH值＞酶解時間＞酶的復配比＞酶解溫度。水解度最高的酶解最佳工藝組合為A3B3C1D2；而以肽得率為評價指標，影響肽得率的因素主次關系是A＞C＞B＞D，即酶的復配比＞酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度。肽得率最高的酶解工藝組合為A2B3C2D2。

由表3可知，因素A、B、C對水解度影響達到極顯著水平（P＜0.01），因素D對水解度影響達到顯著水平（0.01＜P＜0.05）；因素A、C對肽得率影響達到極顯著水平（P＜0.01），因素B、D在實驗水平范圍內對肽得率幾乎沒有顯著影響。

表2　辣椒粕蛋白酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization of hot pepper residues protein

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3最優組合驗證試驗

由于理論最優水平組合A3B3C1D2或A2B3C2D2均未出現在試驗方案中，故應進行驗證試驗，即組合A3B3C1D2酶解條件為：復合蛋白酶和風味酶的質量比為3∶1，總酶用量為2%，酶解時間為6 h，酶解pH值為6.0，酶解溫度為50℃進行酶解試驗，測得酶解液的水解度為19.31%，肽得率為6.41%。組合A2B3C2D2酶解條件為：復合蛋白酶和風味酶的質量比為2∶1，總酶用量為2%，酶解時間為6 h，酶解pH值為6.5，酶解溫度為50℃進行酶解試驗，測得酶解液的水解度為19.44%，肽得率為6.52%。經驗證試驗比較得出，最優的水平組合為A2B3C2D2。

3　結論

通過單因素和正交試驗確定了復合蛋白酶和風味酶雙向酶解辣椒粕蛋白的最佳工藝條件為復合蛋白酶和風味酶的質量比為2∶1（g∶g），總酶用量為2%，酶解時間為6 h，酶解pH值為6.5，酶解溫度為50℃。在此條件下得到的辣椒粕蛋白酶解液的水解度為19.44%，肽得率為6.52%。因此，酶解是一條優化辣椒粕蛋白的途徑，研究結果為酶解辣椒粕蛋白制備呈味肽或抗氧化肽等提供了理論依據，今后還將對不同酶制劑組合復配水解植物蛋白（hydrolyzed vegetable protein，HVP）生產增味香精提供參考，以期達到低值植物蛋白的高值化利用，對蛋白質的精深加工具有重要的指導意義。

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Technology of hot pepper residues protein hydrolysis by double enzymes

ZHAO Jing，WANG Yan*
（College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

With hydrolysis degree and peptide yield as evaluation index，the hot pepper residues protein was hydrolyzed by double enzymes（protamex and flavorzyme）method and its hydrolysis technology was researched.On the base of single factor experiments，the hydrolysis technology was optimized by orthogonal experiment.The results showed that the optimum hydrolysis technology conditions were as follows：protamex and flavorzyme mass ratio 2∶1，total enzyme addition 2%，hydrolysis time 6 h，pH 6.5，hydrolysis temperature 50℃.Under this condition，the hydrolysis degree was 19.44%，the peptide yield was 6.52%.

hot pepper residues；protease；enzymatic hydrolysis

X705

A

0254-5071（2015）11-0066-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.015

2015-10-10

湖南省教育廳重點項目（編號：13A040）

趙靜（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養。

王燕（1968-），女，教授，博士，研究方向為食品化學與營養。