利用啤酒廢酵母擴培物制備富含谷胱甘肽酵母抽提物

陳志穎，張子健*，焦瑞杰，江建梅，舒　媛，徐婷婷，吳　振（唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山063000）

利用啤酒廢酵母擴培物制備富含谷胱甘肽酵母抽提物

陳志穎，張子健*，焦瑞杰，江建梅，舒媛，徐婷婷，吳振
（唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山063000）

該研究利用啤酒廢酵母制備富含谷胱甘肽的酵母抽提物，旨在開發酵母利用的新途徑。以啤酒廢酵母為原料，經單因素試驗和響應面分析法，得到了谷胱甘肽提取的最佳工藝條件：料液比1∶4（g∶mL）、提取溫度85℃、提取時間20 min、pH 1.86，在此條件下谷胱甘肽的提取率可達到35.06%；最后確定了谷胱甘肽提取液的最佳濃縮溫度為50℃，最佳濃縮時間為40 min，制備得到的酵母抽提物中谷胱甘肽含量為4.11%，固形物含量達到61.87%。

谷胱甘肽；酵母抽提物；啤酒廢酵母

谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸（glutathione，GSH），是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經肽鍵縮合而成的一種同時具有γ-谷氨酰基和巰基的生物活性三肽化合物［1-3］，由于其在生物體內具有清除自由基、解毒、促進鐵質吸收及維持紅細胞膜的完整性、維持脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的生物合成、細胞的正常生長及細胞免疫等多種生理功能［4-6］，因此被廣泛應用于食品、醫藥、保健品、化妝品工業中［7-8］。谷胱甘肽的提取方式主要有熱水抽提法、乙醇萃取法、酶法、超聲波法、微波處理法、高壓脈沖法等［9-10］。其中熱水抽提法分離時間相對較短，減少了生產過程中GSH的氧化損失，溶劑為水，不需要其它溶劑，可以節省費用，用于工業化生產設備投資要小。鑒于后期工業化生產的可行性，本實驗中采用熱水抽提法對谷胱甘肽進行提取。

啤酒廢酵母是啤酒釀造中的副產物，細胞中含有大量的GSH，目前的研究均以提純酵母細胞中的GSH為主，而制備富含GSH酵母抽提物的研究甚少報道［11-15］。本研究首先對啤酒廢酵母進行擴培以富集GSH，然后以啤酒廢酵母擴培物為原料，以GSH提取率為評價指標，采用單因素試驗結合響應面分析法對GSH的提取工藝進行優化，并確定了最佳的過濾方式——陶瓷膜法，改善了傳統離心分離方式的諸多缺點，提高了GSH提取率，最后將最優工藝條件下所得的GSH提取液濃縮獲得富GSH的酵母抽提物，為富GSH酵母抽提物的工業化生產提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

啤酒廢酵母泥：由唐山拓普生物科技有限公司提供。

鹽酸（36%～38%）：天津市凱信化學工業有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；辛烷磺酸鈉（純度≥99.0%）、還原型谷胱甘肽標準品（純度≥98.0%）：美國Sigma公司；乙腈（純度99.9%）：德國默克股份有限公司；磷酸（分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠。

1.1.2培養基

擴培培養基：蔗糖2%，酵母膏1%，硫酸銨1%，硫酸鎂0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，磷酸二氫鉀0.1%，丙酸鈣0.1%，乳酸鏈球菌肽（Nisin）0.03%，pH 4.5，6 h后添加10 mmol/L L-半胱氨酸。

1.2儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺：上海博訊實業有限公司；CF16RN高速冷凍離心機：天美（中國）科學儀器有限公司；ZWY-1102C恒溫振蕩培養箱：上海智誠科技投資有限公司；DZKW-4數顯恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；SFG-02.500數顯鼓風干燥箱：黃石市恒豐醫療器械有限公司；80目標準篩（φ200 mm×50 mm）：浙江道墟化工廠；UV-9600紫外可見分光光度計：北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VDRTEX-5旋渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HLPC）：河北鼎恒商貿有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1啤酒廢酵母擴增培養

將啤酒廢酵母泥在3000r/min下高速冷凍離心10min，得到廢酵母菌體，以8%接種量接種于裝液量為60 mL/250 mL擴培培養基中，于26℃下，180 r/min振蕩培養26 h，得到酵母擴培液。將其過80目標準篩，在3 000 r/min下高速冷凍離心10 min，得沉淀，用純水清洗2遍，得到潔凈酵母菌體。

1.3.2谷胱甘肽提取工藝優化

GSH抽提液制備：采用熱水抽提法對谷胱甘肽進行提取。稱取一定量的潔凈酵母菌體，加入2～6倍純水，調節pH值為1～5，于75～95℃的熱水中提取10～30 min，至于冰水浴中迅速冷卻，分離得清液即為GSH抽提液。

單因素試驗：探討料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL））、提取時間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）、提取溫度（75℃、80℃、85℃、90℃、95℃）和pH值（自然、1.0、2.0、3.0、4.0）等因素對GSH提取率的影響。

響應面分析法：綜合單因素試驗結果，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原則，選取影響較大的3個因素提取溫度、提取時間和pH值，以谷胱甘肽提取率為評價指標，采用3因素3水平的響應面分析方法對啤酒廢酵母中谷胱甘肽的提取進行優化，各因素及水平編碼如表1所示。

1.3.3富含GSH酵母抽提物的制備

將最優提取工藝條件下獲得的GSH抽提液在40～60℃下進行濃縮，最終得到固形物含量＞60%的酵母抽提物，采用高效液相色譜法檢測其谷胱甘肽的含量。該研究考察了濃縮溫度和濃縮時間對GSH的損失率的影響。

1.3.4高效液相色譜法測定GSH含量［16-17］

色譜條件：Symmetry C18色譜柱（5 μm，319 mm× 150 mm）；流動相：磷酸二氫鈉和辛烷磺酸鈉混合溶液（磷酸二氫鈉310 g，辛烷磺酸鈉110 g，加水溶解并定容至500 mL，用磷酸調節pH為3.0）∶乙腈=96∶4（V∶V）；檢測波長：210 nm；流速：110 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

樣品處理和檢測：將樣品進行適當稀釋或濃縮，過0.45 μm濾膜作為樣品分析液。分別取已制備好的樣品分析液和標準對照溶液10 μL，在相同色譜條件下，以保留時間定性，峰面積定量。根據樣品峰的峰面積，在標準曲線上查含量，得樣品中谷胱甘肽的含量。谷胱甘肽提取率及損失率計算公式如下：

1.3.5數據統計分析

每次試驗重復3次，單因素試驗數據采用Excel 2003處理，響應面試驗數據采用Design Expert 8.0軟件進行回歸和方差分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1料液比對GSH提取率影響

圖1　料液比對GSH提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of GSH

由圖1可知，在提取溫度90℃，提取時間15 min，pH 3.0條件下，隨料液比的增加，GSH提取率不斷提高，料液比為1∶4（g∶mL）時，GSH提取率為24.87%，之后增幅不明顯，料液比對GSH提取率影響較大，因此選取料液比1∶4（g∶mL）進行后續試驗。

2.1.2提取溫度對GSH提取率影響

圖2　提取溫度對GSH提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of GSH

由圖2可知，在料液比1∶4（g∶mL），提取時間15 min，pH 3.0條件下，隨提取溫度的提高，GSH提取率不斷提高，提取溫度為85℃時，GSH提取率達到25.25%，之后逐漸下降，因此，GSH提取最優溫度為85℃。

2.1.3提取時間對GSH提取率影響

圖3　提取時間對GSH提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of GSH

由圖3可知，在料液比1∶4（g∶mL），提取溫度85℃，pH 3.0條件下，隨提取時間的延長，GSH提取率不斷提高，20min時，GSH提取率為25.86%，之后逐漸下降，因此，GSH提取最優時間為20 min。

2.1.4 pH值對GSH提取率影響

圖4　pH值對GSH提取率的影響Fig.4 Effect of pH value on the extraction rate of GSH

由圖4可知，在料液比1∶4（g∶mL），提取溫度85℃，提取時間20 min條件下，pH值自然時（一般pH為5～6），GSH提取率最低，pH為1.0時，GSH提取率最高為28.78%，隨pH值的增大，GSH提取率越來越低，這與文獻［9］中所述GSH在酸性環境下較為穩定相符合。因此，GSH提取最優pH值為1.0。

2.2響應面分析

利用Design Expert 8.0軟件，采用中心組合試驗Box-Behnken設計方案，以GSH提取率（Y）為響應值進行3因素3水平的響應面試驗，因素水平編碼表見表1。試驗共設17個試驗點，包括12個析因點和5個中心點，結果如表2所示。

表2　Box-Behnken中心組合試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken central composite experiment

利用Design Expert 8.0軟件對表2試驗數據進行回歸分析，經回歸擬合后，各因素與響應值的回歸方程為：

為了檢驗回歸方程的有效性，對該模型進行回歸方差分析顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，模型的F值為156.62、P＜0.000 1，說明模型極顯著，失擬項F值為0.015、P值為0.997 0，差異不顯著，說明未知因素對試驗結果影響小。該模型的復相關系數R2=0.995 1，修正相關系數R2adj=0.988 7，這說明該試驗模型的擬合程度良好，能夠很好地描述試驗的結果，自變量和響應值之間呈現顯著的線性關系，試驗誤差較小，模型方程可以很好地反映真實的工藝結果。由方差分析表3可知，各因素對響應值影響的主次順序為C（pH值）＞A（提取溫度）＞B（提取時間）。

表3　回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

根據回歸模型預測出GSH提取率的最高值。即當提取溫度85.52℃，提取時間20.60min，pH 1.86時，預測出GSH提取率的最大值為35.15%。為了驗證響應面模型的有效性，實際操作過程選擇提取溫度85℃，提取時間20 min，pH 1.86，經3次驗證試驗，在此最優提取工藝條件下，GSH平均提取率為35.06%，實際值比預測值誤差為±0.26%，可見模型很好的預測了試驗結果。

根據方差分析和回歸方程，得到三維響應曲面圖及等高線見圖5，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析提取溫度、提取時間和pH對GSH提取率的影響。由圖5可直觀反映各因素間交互作用對響應值的影響，其中等高線的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素之間交互作用顯著，圓形則與之相反。

圖5　提取溫度、提取時間和pH值交互作用對GSH提取率的影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and countour line of effect of interaction between extraction temperature，extraction time and pH on the extraction rate of GSH

2.3富GSH酵母抽提物的制備

2.3.1濃縮條件的優化

對GSH提取液進行真空濃縮可得到富GSH酵母抽提物，但由于在濃縮環節GSH會有一定的損失，對濃縮溫度進行了考察。每次濃縮抽提液的體積為200 mL，以國標GB/T 23530—2009《酵母抽提物》中方法檢測固形物含量（國標要求≥60%），結果見表4。由表4可知，在濃縮溫度50℃時濃縮40 min，GSH損失率最低（6.78%）。因此，最佳的濃縮溫度為50℃，時間為40 min，最終固形物含量為61.87%［18］。

表4　濃縮條件對GSH損失率的影響Table 4 Effect of concentrating conditions on the loss rate of GSH

2.3.2酵母抽提物中谷胱甘肽含量的檢測

高效液相色譜檢測酵母抽提物中谷胱甘肽含量結果見圖6。結果表明，最終酵母抽提物產品中GSH含量為4.11%。

圖6　酵母抽提物中谷胱甘肽含量檢測HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of the contents of GSH in yeast extract

3　結論

本研究首先對啤酒廢酵母進行擴培，使其酵母細胞內富集GSH，然后通過單因素試驗和Box-Behnken中心組合設計原理以及響應面分析法對啤酒廢酵母中提取GSH的工藝進行了優化，擬合了提取溫度、提取時間和pH值3個因素對GSH提取率的回歸模型，經檢驗證明該模型合理可靠，能較好的預測GSH提取率，由該模型確定的最佳工藝條件為提取溫度85℃、提取時間20 min和pH 1.86，經3次驗證試驗，GSH平均提取率可達到35%以上。最后考察了濃縮溫度和濃縮時間對成品中GSH的影響，得到50℃濃縮40minGSH損失率最低，經高效液相色譜檢測，成品中GSH含量平均為4.11%，固形物含量達到61.87%。本研究利用啤酒廢酵母制備獲得富含GSH的酵母抽提物，可廣泛應用于食品、保健品和寵物飼料中，不僅提高了酵母類產品的附加值，還達到了節約資源、減少污染的目的，對酵母深加工行業的發展有著深遠意義。

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Preparation of yeast extracts rich in glutathione using the propagated culture of waste beer yeast

CHEN Zhiying，ZHANG Zijian*，JIAO Ruijie，JIANG Jianmei，SHU Yuan，XU Tingting，WU Zhen
（Tangshan TOP Bio-Technology Co.，Ltd.，Tangshan 063000，China）

In order to develop a new way of yeast usage，yeast extract rich in glutathione（GSH）was made by waste beer yeast.Using waste beer yeast as raw material，the optimum conditions of GSH extraction were determined by single factor experiments and response surface analysis method.The results showed that the optimum conditions were solid-liquid ratio 1∶4（g∶mL），extraction temperature 85℃，extraction time 20 min，pH 1.86.Under this condition，the extraction rate of GSH could reach 35.06%.Finally，the optimum concentration temperature of GSH extraction solution was 50℃，and the optimum concentration time was 40 min.GSH content in yeast extract was 4.11%，and the solid content was 61.87%.

glutathione；yeast extract；waste beer yeast

R284.2

A

0254-5071（2015）11-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.014

2015-09-14

唐山市科技計劃項目（No.13110205A）

陳志穎（1972-），女，高級工程師，博士，研究方向為酵母及酵母衍生品。

張子?。?984-），女，工程師，碩士，研究方向為食品微生物。