不同發酵階段紅曲黃酒滋味品質變化的比較研究

郭　壯，蔡宏宇，李建美，王玉榮，朱作容，梁　英*（湖北文理學院化學與食品學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053）

不同發酵階段紅曲黃酒滋味品質變化的比較研究

郭壯，蔡宏宇，李建美，王玉榮，朱作容，梁英*
（湖北文理學院化學與食品學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053）

采用電子舌技術和多變量統計學方法相結合的手段，對不同發酵階段紅曲黃酒的滋味品質進行了評價。結果表明，發酵過程中紅曲黃酒的基本味均會發生顯著的變化，其中發酵0～3 d時其變化最為明顯。通過非線性多維標度分析和聚類分析發現，按照滋味整體結構相似性的大小可將其發酵過程劃分為0～3 d，3～9 d和9～15 d三個階段。通過多元方差分析發現發酵3～8 d和9～15 d的紅曲黃酒其滋味品質整體結構存在顯著差異，使用冗余分析進一步分析發現該差異是由于鮮味、豐度（鮮味回味）以及澀味等三個指標導致的。由此可見，發酵3～9 d可能是紅曲黃酒滋味品質形成的關鍵階段。

紅曲黃酒；電子舌；發酵過程；品質評價

紅曲黃酒通常以糯米為主要原料，通過添加紅曲經糖化發酵釀制而成，其成品色紅、味醇、香濃，是我國黃酒中十分有特色的一類產品［1］。作為紅曲黃酒釀造中常用的功能活性酒曲，紅曲中含有的紅曲霉在生長代謝過程中可以產生γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、莫納可林K（Monacolin K）和紅曲色素等多種生理活性物質，現代研究成果表明，這些物質具有降血脂［2］和抗腫瘤［3］的功效。近年來，國內研究人員在紅曲黃酒新產品開發［4-5］、香氣成分構成［6］、生產工藝條件優化［7-8］和發酵醪液中微生物多樣性揭示［9］等方面開展了大量卓有成效的研究。但目前國內關于紅曲黃酒尤其是不同發酵階段紅曲黃酒滋味品質評價的研究報道尚少。

鄭翠銀等［10］運用定量描述分析法對4個類型的12種市售福建紅曲黃酒進行了感官鑒定，得到了描述紅曲黃酒滋味的滋味輪，同時確定了紅曲黃酒滋味特征語言庫，構建了一個獨立、科學、有效的紅曲黃酒滋味品質的評價體系。除了采用感官鑒評的方法外，研究人員亦可以采用電子舌對紅曲黃酒的滋味品質進行評價。通過采用人工脂膜傳感器技術，電子舌可以實現食品或藥品的苦、澀、鮮、咸和酸5個基本味及苦、澀和鮮3個基本味的回味指標的測定，具有感受閾值和感知味強度與人保持一致，結果準確可靠的優點［11］，目前已在酒的產地鑒別［12-13］、品種鑒別［14-15］和酒齡識別［16-17］等方面有了廣泛的應用，但其在紅曲黃酒中的應用報道還尚少。

為了對紅曲黃酒發酵過程中的滋味品質變化進行揭示，本研究擬每隔24 h對發酵中的紅曲黃酒樣品進行采集，累計持續15 d，同時擬采用電子舌技術和多元統計學方法相結合的方法，研究紅曲黃酒發酵過程中各滋味指標強度的變化規律，分析不同發酵時間紅曲黃酒滋味品質整體結構的差異性，并對與其滋味品質整體結構差異顯著相關的指標進行鑒定。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

糯米：襄陽市天天福超市；酒曲：麗水力克生物科技有限公司；內部溶液、參比溶液、陰離子溶液、陽離子溶液：日本Insent公司；硫酸銅（分析純）、酒石酸鉀鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、次甲基（分析純）、葡萄糖（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽市化學試劑廠。

1.2儀器與設備

SA 402B電子舌：日本Insent公司；4盤電汽蒸飯柜：山東上美廚房設備廠；LRH-150生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SHZ-D水循環多用真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-25 pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；KDM可調控溫電熱套：山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；CL-1磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3方法

1.3.1紅曲黃酒的制作

糯米經浸泡、蒸熟、攤涼和淋冷等操作后，添加25 g酒曲/1 000 g糯米將兩者攪拌均勻，并添加煮沸冷涼的2.5倍糯米質量的純凈水，置于儲釀罐中28℃發酵15 d。紅曲黃酒發酵過程中每隔24 h取樣一次，分別編號為發酵1 d至發酵15 d，同時將未發酵的樣品進行留樣，編號為發酵0 d。

1.3.2黃酒樣品的預處理

取200 g紅曲黃酒樣品，3 000g×離心10 min后取上清液抽濾，濾液備用。

1.3.3使用電子舌對紅曲黃酒樣品進行測定

參照文獻［18］的方法，使用電子舌對不同發酵時間紅曲黃酒樣品的酸、苦、澀、鮮和咸5個基本味及苦、澀和鮮3個基本味的回味進行測定。即傳感器首先在參比溶液中測得參比溶液電勢Vr；然后測得樣品溶液電勢Vs，通過不同傳感器Vs-Vr的電勢差值得到5個基本味的強度值；經洗滌后，傳感器于參比溶液中檢測到電勢Vr'，通過Vr'-Vr的電勢差值得到3個回味的強度值。每個樣品重復測4次，選取后3次測量各滋味值的相對強度作為本研究分析的原始數據。將發酵0 d樣品的各滋味強度均定義為0，待測樣品的滋味值減去發酵0 d樣品的滋味值即為相對強度。

1.3.4統計分析

使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對各滋味指標的差異性進行分析；使用非線性多維標度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和聚類分析（cluster analysis，CA）對不同發酵時間紅曲黃酒滋味品質整體結構的差異性進行分析，使用歐氏距離（Euclidean distance）對紅曲黃酒發酵3～8 d和9～15 d時滋味品質整體結構的組間差異進行分析，使用Mann-Whitney分析和冗余分析（redundancy analysis，RDA）對與上述兩個時間段紅曲黃酒滋味品質整體結構差異顯著相關的指標進行分析。RDA分析采用canoco 4.5軟件，其他分析均采用Matlab 2010b軟件。

2　結果與分析

2.1紅曲黃酒發酵過程中各滋味指標強度的變化

由表1可知，發酵過程中紅曲黃酒樣品的酸、苦、澀、鮮和咸5個基本味強度變化非常顯著（P＜0.01）。由總變異值的大小可知，紅曲黃酒發酵中酸味的變化幅度最大，其次為鮮味、咸味和苦味，而澀味的變化幅度較小。由極差可知，上述5個指標的極差值均大于1，即不同發酵時間段的紅曲黃酒樣品其滋味品質的差異即使通過感官鑒評也可以區分出來。值得一提的是，發酵過程中黃酒樣品的后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）等3個回味指標變化不顯著（P＞0.05）。

表1　紅曲黃酒發酵過程中各滋味指標強度差異性的分析（n=16）Table 1 The significance analysis of each taste index of red-kojic rice wine in different fermentation time（n=16）

黃酒中的酸以乳酸和乙酸為主，同時又含有焦谷氨酸、琥珀酸和酒石酸等有機酸類，其具有增強黃酒濃厚味的作用［19］。紅曲黃酒的釀造實質是一個開放式的發酵過程，由乳酸菌、霉菌和酵母菌等多種微生物共同參與完成［20］。乳酸菌在黃酒的發酵過程中起著極為重要的作用，其代謝產生的有機酸是風味物質的主要來源，同時產生的細菌素亦可以抑制部分雜菌的生長［21］。KIM S Y等［22］使用變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術發現15份韓國米酒Takju中均含有Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum和Leuconostoc pseudomesenteroide等乳酸菌。由此可見，紅曲黃酒發酵中酸味的變化幅度最大，這在一定程度上說明在發酵過程中乳酸菌的種類和數量可能會產生較大的變化。然而令人遺憾的是，目前關于黃酒尤其是紅曲黃酒發酵過程中乳酸菌群落結構動態變化的研究報道尚少。因此，后期采用DGGE等指紋圖譜技術或高通量測序技術［23］，同時結合實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polyerase chain reaction，qPCR）技術對不同發酵階段紅曲黃酒發酵醪液中的乳酸菌的豐度和多樣性進行研究是極為必要的。紅曲黃酒發酵過程中基本味和回味指標強度變化曲線見圖1。

圖1　紅曲黃酒發酵過程中基本味（A）和回味（B）各滋味指標強度變化曲線Fig.1 Change curve of abundance of each taste index of basic taste（A）and after taste（B）in different fermentation time of red-kojic rice wine

由圖1（A）可知，發酵過程中紅曲黃酒的酸味強度不斷增強，而苦味呈現出相反的趨勢，但其增強或下降的趨勢在0～3 d時最為明顯。紅曲黃酒發酵過程中澀味、咸味和鮮味均呈現出先下降再上升的趨勢，其中澀味、咸味和鮮味強度的最小值分別出現在發酵1 d、2 d和3 d時。值得一提的是，發酵過程中黃酒的澀味在3 d時變化趨勢趨于穩定，且趨向于零。由此可見，發酵0～3 d時紅曲黃酒滋味品質的各滋味指標變化均較為明顯。由圖1（B）可知，發酵過程中紅曲黃酒澀味、苦味和鮮味的回味變化趨勢不明顯。

黃酒中的苦味主要來源于發酵過程中微生物代謝所產生的高級醇、酪醇、氨基酸和二肽等物質［24］。當發酵醪液受到污染時，酵母菌和乳酸菌共同作用產生的丙烯醛，會使黃酒有較大的持續性的苦味［25］。此外，如果酒曲添加量過多或發酵溫度過高均會導致酵母自溶后產生大量氨基酸，從而引起高級醇含量的升高以及酪醇的生成，進一步導致了黃酒苦味的產生［26］。

2.2不同發酵時間黃酒滋味品質整體結構的差異性分析

滋味是多種滋味物質相互作用的結果，其相互作用包含相殺、中和、加成作用等［27］，因此僅孤立的對紅曲黃酒的某一個滋味指標進行評價是不足的。在對紅曲黃酒發酵過程中各滋味指標豐度的變化進行研究的基礎上，本研究進一步以不同發酵時間黃酒樣品滋味指標的測量數據為研究對象，采用NMDS、CA和MANOVA等多元統計學方法對其滋味品質整體結構的變化進行了分析。

圖2　不同發酵時間紅曲黃酒樣品非線性多維標度分析排序圖Fig.2 Non-metric multidimensional scaling sequencing graph of red-kojic rice wine in different fermentation time

作為一種多維尺度圖示分析技術，通過利用有序測量尺度，NMDS可將不同樣品之間的相似距離用低維空間中點與點之間的距離表示出來［28］。由圖2可知，不同發酵時間的樣品空間排布呈現出一定的聚類趨勢，其中未發酵、發酵1 d和2 d的樣品均位于第四象限，發酵3～8 d的樣品均位于第二或第三象限，而發酵9～15 d的樣品均位于X軸正方向或第一象限。這說明未發酵、發酵1 d和2 d的樣品其滋味品質整體結構較為相似，同理9～15 d的樣品亦較為相似。發酵3 d與發酵2 d和4 d時的樣品空間距離較遠，同時發酵8 d與發酵7 d和9 d時的樣品也呈現出相同的趨勢，因此可以初步推斷，紅曲黃酒在發酵3 d時其滋味品質整體結構開始形成，而在發酵9 d時趨向于穩定，發酵3～9 d時可能是紅曲黃酒滋味品質形成的關鍵階段。

未發酵、發酵1 d和2 d的樣品及發酵9～15 d的樣品其空間排布較為集中，而發酵3～8 d的樣品排布較為分散，這說明發酵3～8 d時紅曲黃酒的滋味品質變化明顯，而發酵9 d以后其滋味變化趨勢減緩，這一點在圖1中也得到了證實。本研究采用歐式距離分別計算了發酵3～8 d和9～15 d時紅曲黃酒樣品組內滋味品質整體結構的平均距離，結果發現其組間距離分別為3.21±0.74和2.61±0.65（Xˉ±SD），然而經Mann-Whiney檢驗發現兩者差異均不顯著（P＞0.05）。

為了進一步驗證NMDS分析的結果，采用馬氏距離聚類對不同發酵階段紅曲黃酒的滋味品質整體結構進行了分析，結果見圖3。由圖3可知，當平均距離取10的時候，16個紅曲黃酒樣品可以分成三個聚類，其中未發酵和發酵1 d的樣品可以形成第一個聚類，發酵2 d的樣品單獨形成第二個聚類，而發酵3～15 d的樣品可以形成第三個聚類。由此可見，發酵0～3 d時紅曲黃酒滋味品質整體結構變化均較為明顯，這與圖1觀察到的結果是一致的。值得一提的是，當平均距離取7時，上述第三個聚類可以進一步分為兩個小的聚類，其中第一個小聚類由發酵3～8 d的紅曲黃酒樣品組成，第二個聚類由發酵9～15 d的樣品組成。本研究進一步采用MANOVA對發酵3～8 d和9～15 d的紅曲黃酒滋味品質的差異性進行了分析，結果發現兩個時間段的黃酒樣品其滋味差異顯著（P＜0.05）。由此可見，發酵8～9d時紅曲黃酒的滋味品質整體結構可能會發生較顯著的變化。綜上所述，發酵3～9 d可能是紅曲黃酒滋味品質形成的關鍵階段。

圖3　基于馬氏距離不同發酵時間紅曲黃酒滋味品質的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the taste profile characterization of red-kojic rice wine in different fermentation time based on mahalanobis distance

2.3發酵不同階段紅曲黃酒滋味品質整體結構差異顯著相關指標的鑒定

圖4　冗余分析雙序圖Fig.4 Double sequence diagram of redundancy analysis

通過上述分析證實發酵3～9 d可能是紅曲黃酒滋味品質形成的關鍵階段，由圖1發現發酵0～3 d時紅曲黃酒各滋味指標的變化趨勢，而究竟是因為哪些指標的不同導致了發酵3～8 d和9～15 d黃酒樣品滋味品質整體結構具有顯著差異是需要進一步研究的問題。通過解釋變量的線性組合，RDA可以盡最大可能解釋響應變量的變異度［20］。在上述分析中，通過采用MANOVA證實了發酵3～8 d和9～15d的紅曲黃酒滋味品質存在顯著的差異，因而在RDA分析中，以紅曲黃酒的不同發酵階段（3～8 d/9～15 d）作為起約束作用的解釋變量，用于預測和解釋全部8個滋味指標數據組成的響應變量。由圖4可知，鮮味、豐度（鮮味回味）以及澀味等3個指標與RDA排序圖約束軸上的樣本賦值良好相關，由此可見，正是上述3個指標代表了發酵3～8 d和9～15 d時黃酒樣品滋味品質總體結構差異顯著相關的關鍵滋味。由圖4亦可知，鮮味和豐度（鮮味回味）指標位于圖的左邊（即發酵9～15 d）而澀味位于右邊（即發酵3～8 d），這說明隨著發酵時間的延長，發酵9～15 d的紅曲黃酒其鮮味及鮮味的回味強度較之3～8 d時高，而澀味呈現出相反的趨勢。經Mann-Whitney檢驗發現，上述3個滋味指標在兩個發酵時間段的紅曲黃酒樣品中差異具有統計上的顯著性（P＜0.01）。

3　結論

通過采用電子舌對不同發酵階段紅曲黃酒的基本味和回味進行測定，結果表明：發酵過程中紅曲黃酒的酸味、苦味、澀味、鮮味和咸味均會發生顯著的變化，而回味變化不顯著。按照紅曲黃酒滋味整體結構相似性的大小，可以將紅曲黃酒的發酵過程劃分為0～3 d，3～9 d和9～15 d三個階段，其中發酵3 d后紅曲黃酒的整體滋味品質開始形成，發酵9 d后趨向于穩定，因而3～9 d可能是紅曲黃酒滋味品質形成的關鍵階段。

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Comparative study on the taste profile characterization of red-kojic rice wine in different fermentation time

GUO Zhuang，CAI Hongyu，LI Jianmei，WANG Yurong，ZHU Zuorong，LIANG Ying*
（Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food，College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，China）

The taste profile characterizations of red-kojic rice wine in different fermentation period were studied by electronic tongue and multivariate statistics.Results indicated that there were significant changes of basic taste of red-kojic rice wine in different fermentation time，especially during 0-3 d.Through nonlinear multidimensional scaling and cluster analysis，the fermentation process of red-kojic rice wine could divided into three stages based on the taste profile similarity，namely 0-3 d，3-9 d and 9-15 d.Multivariate analysis of variance showed that there was significant difference in the taste profile characterization of red-kojic rice wine fermented at 3-8 d and 9-15 d.Meanwhile，umami，richness，and astringency were identified by redundancy analysis as key variables significantly associated with the taste profile difference.Thus，it can be concluded that fermentation period of 3-9 d was probably a key state for taste profile formation.

red-kojic rice wine；electronic tongue；fermentation process；quality evaluation

TS262.4

A

0254-5071（2015）11-0056-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.013

2015-10-13

湖北省教育廳科學技術研究計劃中青年人才項目（Q20152603）

郭壯（1984-），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。

梁英（1967-），女，教授，博士，研究方向為綠色化學與生物質工程技術。