常壓室溫等離子體誘變選育高產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌

孟　武，丁雪梅，王瑞明，肖冬光*（.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；.齊魯工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，山東濟南50353）

常壓室溫等離子體誘變選育高產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌

孟武1，2，丁雪梅1，王瑞明2，肖冬光1*
（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.齊魯工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，山東濟南250353）

地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis）可以利用葡萄發(fā)酵產(chǎn)生四甲基吡嗪，四甲基吡嗪廣泛應(yīng)用于食品、臨床和其他領(lǐng)域。該文以地衣芽孢桿菌BL1為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)進行誘變，根據(jù)脫脂奶粉平板初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，連續(xù)傳代培養(yǎng)后得到遺傳穩(wěn)定的四甲基吡嗪產(chǎn)量較高的突變株BT12，該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)四甲基吡嗪的最大產(chǎn)量為43.16 g/L，相比出發(fā)菌株的37.89 g/L的提高了13.91%。

常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)；地衣芽孢桿菌；四甲基吡嗪；選育

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，是中藥川芎中的有效活性成分［1-2］，在治療腦血管、肺水腫、胃潰瘍、腎臟疾病方面有顯著療效，作為常備藥品廣泛應(yīng)用于臨床。TTMP又是一種重要的呈香物質(zhì)，天然存在于可可豆、茶、牛羊豬肉、奶酪、咖啡、花生、堅果、白酒中，具有烤肉、烤面包等香氣，GB2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定其為允許使用的食用香料，被美國食品香料和萃取物制造者協(xié)會風(fēng)味和提取制造委員會（Flavour Extract Manufacturers'Association，F(xiàn)EMA）認定為公認安全物質(zhì)（generallyrecognizedassafe，GRAS），可作為食品中的調(diào)味劑［3］。在白酒釀造中TTMP是其風(fēng)味形成的重要物質(zhì)，對白酒質(zhì)量和保健效果有重要影響［4-5］。目前，TTMP主要通過微生物發(fā)酵、直接提取和化學(xué)合成3種方法進行。吡嗪類物質(zhì)的化學(xué)合成法主要有Strecker降解化學(xué)法、美拉德反應(yīng)以及非Strecker降解化學(xué)法，但是此方法生產(chǎn)TTMP普遍存在設(shè)備要求較高、反應(yīng)條件劇烈、環(huán)境污染嚴重、產(chǎn)品非天然等問題。直接提取法主要是從稀少的藥用植物川芎中提取，但是由于來源有限和提取成本過高而無法進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。與以上兩種方法相比，微生物發(fā)酵法具有無污染、安全性高、應(yīng)用性強等優(yōu)點。

目前，乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcuslactissubsp. lactisbiovar.diacetylactisFC1）［6］、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）突變株［7］和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［8-9］是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)TTMP的主要菌株，也有利用紅曲霉［10］生產(chǎn)四甲基吡嗪的相關(guān)報道。但是，利用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)TTMP的研究較少，相關(guān)研究表明，地衣芽孢桿菌野生菌株可以通過發(fā)酵代謝生成較低量的四甲基吡嗪（mg/L）［11］。對發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基組分和pH值進行優(yōu)化可以提高四甲基吡嗪的產(chǎn)量，但產(chǎn)物達到一定濃度后會對整個反應(yīng)過程造成抑制。

常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作簡單、成本低、誘變效果好、成功率高等優(yōu)點［12-13］，是常用的微生物育種技術(shù)。研究表明，該技術(shù)可以快速誘變酵母、霉菌、微藻等微生物，并且可以在較短的時間內(nèi)獲得遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的突變株［14-15］。所以本研究利用ARTP對TTMP產(chǎn)生菌——地衣芽孢桿菌（Bacillcus lincheniformis）BL1進行誘變，以期建立常壓室溫等離子體誘變和平板篩選四甲基吡嗪高產(chǎn)菌株的方法，并對突變株進行遺傳穩(wěn)定性試驗，最終獲得四甲基吡嗪產(chǎn)量較高、遺傳穩(wěn)定性好的菌株。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

地衣芽孢桿菌（Bacillcus lincheniformis）BL1：齊魯工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部王瑞明教授提供。

無水葡萄糖（分析純）、蛋白胨（分析純）：天津市北方北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；酵母粉（分析純）：安琪酵母股份有限公司；磷酸氫二銨（分析純）、無水乙醇（色譜純）、氯化鈉（分析純）、TTMP（色譜純）：天津市天達化工實驗廠。

脫脂牛奶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，脫脂奶粉15 g/L，pH調(diào)至7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂粉。120℃滅菌25 min。

LB種子液體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，pH調(diào)至7.0，120℃滅菌25 min。

LB種子固體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，培養(yǎng)基加2 g/L瓊脂粉，pH調(diào)至7.0，120℃滅菌25 min。

酵母蛋白胨葡萄糖（yeast peptone glucose，YPG）發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨30 g/L，葡萄糖70 g/L，酵母浸粉10 g/L，磷酸氫二銨30 g/L，pH調(diào)至7.5，120℃滅菌25 min。

1.2儀器與設(shè)備

GC7890A氣相色譜儀配7697A頂空固相微萃取（head space-solidphasemicroextraction，HS-SPME）裝置、GC-6890 NPD氮磷檢測器：美國Agilent科技有限公司；ARTP誘變系統(tǒng)：北京思清源生物科技有限公司；UV-722紫外分光光度計：上海欣茂儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：無菌條件下接種一環(huán)活化好的目標(biāo)菌株于250 mL三角瓶中（含有50 mL種子培養(yǎng)基），200 r/min、37℃培養(yǎng)12h。然后按接種量2%（V/V）接到250mL三角瓶中（裝有50mL含10 g/L葡萄糖的LB種子液體培養(yǎng)基），200 r/min、37℃培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)后的種子懸液按4%的接種量（V/V）接種到裝有200 mL含70 g/L葡萄糖的YPG培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8 d。期間每12 h補加5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖溶液。

1.3.2誘變與突變株選育

細胞生物量的估算：將菌種接種于LB種子液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔1h取樣，測定菌液的OD600nm，并取樣，離心，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布平板，計算該吸光度下對應(yīng)的菌落數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

菌懸液的制備：從平板挑一環(huán)活化后的菌種接于液體種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期的中后期，取1 mL菌液測其OD600nm，根據(jù)OD600nm及菌落數(shù)的大體關(guān)系估算菌體濃度，取1 mL菌液8 000 r/min離心2 min，收集沉淀并用生理鹽水洗滌2～3次，將其稀釋至106CFU/mL的菌懸液。

ARTP誘變：取上述菌懸液滴加到載片表面，滴加量為10 μL，后至ARTP誘變系統(tǒng)中誘變，誘變條件見表1。

表1　ARTP照射條件Table 1 Irradiation conditions of ARTP

將上步驟中經(jīng)誘變處理的載片置于裝有1 mL無菌生理鹽水的1 mL離心管中，劇烈振蕩，洗脫載片上的菌液。將所得的菌懸液做7次10倍梯度稀釋，分別取200μL涂布到LB種子固體培養(yǎng)基上，每個梯度涂布5個平板做平行，未經(jīng)誘變的載片作為對照組，在相同的操作和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，進行活菌計數(shù)。

突變株初篩：取誘變后的菌懸液稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)透明圈的大小（吡嗪環(huán)上的氮原子來自氨基酸代謝來源的氨，微生物自身分泌的蛋白酶分解發(fā)酵培養(yǎng)基中的大分子蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸，透明圈的大小顯示了菌株分泌蛋白酶，進而分解蛋白質(zhì)生成氨基酸的能力）及菌落差異挑選菌株，于LB種子固體培養(yǎng)基斜面4℃保存。

突變株復(fù)篩：從篩選平板初篩中挑選透明圈菌落直徑比較大的突變株接入種子培養(yǎng)液，按照1.3.1所述的方法進行種子培養(yǎng)，后將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，按1.3.1所述的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，所得發(fā)酵液進行TTMP產(chǎn)量的分析檢測，TTMP產(chǎn)量最高的菌株即為所要得到的最佳突變株。

突變株遺傳穩(wěn)定性分析：將復(fù)篩所得突變株連續(xù)7代傳代培養(yǎng)，并將各代分別進行相應(yīng)的種子液制備及發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較TTMP的產(chǎn)量變化來測定突變株的遺傳穩(wěn)定性。

菌株形態(tài)觀察：將復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性測定后的目的菌株制成種子液，適當(dāng)倍數(shù)稀釋后按照初篩中的平板涂布條件進行培養(yǎng)和菌落形態(tài)特征觀察，并對菌落生長情況進行拍照記錄。

1.3.3分析方法

（1）致死率計算

對處理過的樣品在適當(dāng)?shù)南♂尪认峦堪澹ㄟ^菌落數(shù)來計算致死率，并獲得致死曲線。致死率計算公式如下：

式中：U為不經(jīng)過誘變處理對照菌的總菌落數(shù)，CFU；T為經(jīng)誘變處理后對應(yīng)的總菌落數(shù)，CFU。

（2）TTMP的測定

頂空條件：平衡溫度65℃，定量環(huán)溫度80℃，傳輸線溫度100℃，平衡時間30 min，壓力平衡時間0.1 min，進樣時間0.5 min，樣品瓶壓力100 kPa。

氣相色譜條件：進樣口溫度250℃，分流比0.5∶1，色譜柱型號為HP-INNOWax（30 m×250 μm×0.25 μm），流速為1mL/min，柱箱升溫程序為50℃保持2min后，以5℃/min升至180℃保持3 min，然后以15℃/min升至230℃保持5 min。檢測器溫度250℃。

（3）細胞生長量的測定

用紫外分光光度計對細胞生長的OD600nm值進行監(jiān)測。

2　結(jié)果與分析

2.1致死率曲線的繪制

誘變結(jié)束后根據(jù)菌種致死率繪制致死率曲線（圖1）。

圖1　不同ARTP照射時間下的致死率曲線Fig.1 Lethality curve of strains with different treatment time

由圖1可見，菌體致死率隨著照射時間的增加而增大。等離子體對該地衣芽孢桿菌的殺傷力比較強，處理30s即可殺死90%的菌體，當(dāng)照射55 s時菌體致死率達到100%。由現(xiàn)代育種理論可知，菌體致死率在90%～95%時正向突變率最高。因此，本實驗選擇提高菌體正向突變率，致死率為92.65%的最佳誘變照射時間35 s。

2.2突變株初篩

出發(fā)菌株BL1誘變結(jié)束后，將菌懸液稀釋一定濃度后涂布到脫脂奶粉培養(yǎng)基上進行初篩，培養(yǎng)一段時間后挑選菌落形態(tài)好、透明圈較明顯的菌落120個。然后將活化后的突變菌涂布到篩選培養(yǎng)基上并與出發(fā)菌株進行對比，選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的20株菌，測量并記錄各自的R值見表2。

表2　BL1菌株與突變株的R值Table 2 The R values of strain BL1 and mutant strains

由表2可知，突變株透明圈菌落直徑比R比出發(fā)菌株都大，表明菌株分泌蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸的能力均比出發(fā)菌株強，其中突變株BT12、BT15、BT55、BT58、BT67、BT86這6株R值與出發(fā)菌株區(qū)別較大。

2.3搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

將表2中所有突變株接種到Y(jié)PG發(fā)酵培養(yǎng)基中進行復(fù)篩，結(jié)果見圖2。

圖2　突變株搖瓶復(fù)篩四甲基丙嗪產(chǎn)量Fig.2 TTMP production of the mutants strains in shake flask screening

由圖2可知，14株突變株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量比BL1高，說明以高產(chǎn)蛋白酶作為篩選高產(chǎn)TTMP枯草芽孢桿菌的依據(jù)是可行的。其中，突變株BT12、BT15、BT55、BT58、BT67、BT86這6株透明圈菌落直徑比R比出發(fā)菌株區(qū)別較大，且產(chǎn)量較出發(fā)菌株產(chǎn)量高得明顯，因此本實驗選擇這6株TTMP產(chǎn)量較高且差異明顯的菌株進行遺傳穩(wěn)定性分析。

2.4突變株遺傳穩(wěn)定性分析

對突變株進行遺傳穩(wěn)定性分析，連續(xù)培養(yǎng)7代以上，以剔除突變株在傳代過程中出現(xiàn)菌株的“衰退”現(xiàn)象的菌株。

用LB培養(yǎng)基斜面分別將突變株BT12、BT15、BT55、BT58、BT67、BT86這6株傳代培養(yǎng)7代，并將各代菌株制成種子液，然后接種到Y(jié)PG發(fā)酵培養(yǎng)基上搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3　突變株的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of mutant strains

由圖3可知，篩選出的6株突變株連續(xù)傳代7代的情況各不相同，其中，BT55、BT58、BT67、BT86連續(xù)傳代7代后均出現(xiàn)了產(chǎn)量下降的現(xiàn)象，表現(xiàn)了遺傳的不穩(wěn)定性。突變株BT12的四甲基吡嗪產(chǎn)量比其他5株都高，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為43.16 g/L，比出發(fā)菌株提高了13.91%，且連續(xù)傳代7代內(nèi)的產(chǎn)量較穩(wěn)定，說明該突變株在傳代過程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。從工業(yè)生產(chǎn)的角度分析，能滿足生產(chǎn)性能穩(wěn)定的要求，即相同的生產(chǎn)條件下菌株性能保持不變。因此，綜合考慮，選擇產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的突變株BT12作為后續(xù)實驗的出發(fā)菌株。

2.5菌落形態(tài)觀察

微生物突變株的獲得往往伴隨著菌落形態(tài)的變化，出發(fā)菌株BL1未經(jīng)誘變時菌落呈白色葉片狀，菌落表面呈淮狀；BL1經(jīng)ARTP誘變后得到的突變株BT12顏色和菌落形態(tài)均發(fā)生變化，呈粉色或微黃褶皺狀，表面粗糙不光滑，即誘變造成了菌落性狀的明顯變化。

3　結(jié)論

本研究表明，ARTP誘變育種方法能夠有效的誘變地衣芽孢桿菌BL1菌株，脫脂奶粉平板初篩結(jié)合搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，篩選出一株TTMP產(chǎn)量升高的地衣芽孢桿菌突變株BT12，該突變株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為43.16 g/L，比出發(fā)菌株提高了13.91%。遺傳穩(wěn)定性分析試驗表明該菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接7代后產(chǎn)量較穩(wěn)定。說明常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（ARTP）能引起地衣芽孢桿菌BL1的基因突變，但是突變株BT12四甲基吡嗪產(chǎn)量提高的原理尚不清楚，有待進一步研究。

［1］趙德義，湯丹丹，曹建全，等.產(chǎn)四甲基吡嗪微生物菌株的選育［J］.中國釀造，2015，34（3）：102-106.

［2］王國明，尹婉嬙，喬陽，等.濃香型“山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)的分析研究［J］.中國釀造，2015，34（4）：146-149.

［3］ADAMS T，DOULL J，F(xiàn)ERON V，et al.The FEMA GRAS assessment of pyrazine derivatives used as flavor ingredients［J］.Food Chem Toxicol，2002，40（4）：429-451.

［4］康文懷，徐巖.中國白酒中風(fēng)味分析及其影響機制的研究［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報，2012，30（3）：53-58.

［5］王慧君，葛霞，田世龍，等.馬鈴薯及其蒸餾酒香氣成分的鑒定［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（15）：270-274，280.

［6］KIM K H，LEE H J，SHON D H，et al.Optimum conditions for the production of tetramethylpyrazine flavor compound by aerobic fed-batch culture ofLactococcuslactissubsp.lactisbiovar.diacetylactisFC1［J］.J Microbiol Biotechn，1994，4（4）：327-332.

［7］DEMAIN A L，JACKSON M，TRENNER N R.Thiamine-dependent accumulation of tetramethylpyrazine accompanying a mutation in the isoleucine-valine pathway［J］.J Bacteriol，1967，94（2）：323-326.

［8］董丹，車振明，關(guān)統(tǒng)偉.白酒酒糟中產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活力特性檢測［J］.中國釀造，2015，34（8）：44-48.

［9］YAMAGUCHI N，TODA T，TERAMOTO T，et al.Effect of sugars on microbiological pyrazine formation byBacillus nattoin synthetic liquid medium［J］.J Jpn Soc Food Sci，1993，40（12）：841-848.

［10］吳晶晶.紅曲霉（Monascus.spp）產(chǎn)生川芎嗪的發(fā)酵工藝條件研究［D］.杭州：浙江大學(xué)碩士論文，2011.

［11］張榮.產(chǎn)醬香功能細菌的篩選及其特征風(fēng)味化合物的研究［D］.無錫：江南大學(xué)碩士論文，2009.

［12］LI H P，LI G，SUN W T.Radio-frequency，atmospheric-pressure glow discharges：producing methods，characteristics and applications in biomedical fields［M］.COMPLEX SYSTEMS：5th International Workshop on Complex Systems.AIP Conference Proceedings，2008.

［13］LI G，LI H P，WANG L Y，et al.Genetic effects of radio-frequency，atmospheric pressure glow discharges with helium［J］.Appl Phys Lett，2008，92（22）：221504.

［14］WANG L Y，HUANG Z L，LI G，et al.Novel mutation breeding method forStreptomyces avermitilisusing an atmospheric pressure glow discharge plasma［J］.J Appl Microbiol，2010，108（3）：851-858.

［15］王立言.常壓室溫等離子體對微生物的作用機理及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究［D］.北京：清華大學(xué)碩士論文，2010.

Screening ofBacillus lincheniformiswith high-yield tetramethylpyrazine by atmospheric room temperature plasma mutation

MENG Wu1，2，DING Xuemei1，WANG Ruiming2，XIAO Dongguang1*
（1.College of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Faculty of Light Industry，Qilu University of Technology，Jinan 250353，China）

Bacillus lincheniformiscan produce tetramethylpyrazine（TTMP）by glucose fermentation，TTMP is widely used in food，clinical application and other fields.UsingB.lincheniformisBL1 as original strain，based on skim milk powder preliminary screening，shake flask fermentation screening，a genetic stable mutant strain BT12 was obtained by atmospheric and room temperature plasma treatment.Compared to the original strain，the maximum TTMP yield increased from 37.89 g/L to 43.16 g/L，which increased by 13.91%.

ARTP；Bacillcus lincheniformis；TTMP；breeding

TS201.3

A

0254-5071（2015）11-0031-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.008

2015-09-25

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃'（2012AA022108）；山東省科技發(fā)展計劃（2014GSF121008）

孟武（1983-），男，講師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。

肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向為現(xiàn)代釀造技術(shù)。