廣陳皮及其近緣種藥用植物的HPTLC研究

高俊麗，邵艷華，李倩，章潤菁，丁平

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

·基礎(chǔ)研究·

廣陳皮及其近緣種藥用植物的HPTLC研究

高俊麗，邵艷華，李倩，章潤菁，丁平*

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：建立廣陳皮揮發(fā)油和黃酮類成分高效薄層色譜指紋圖譜，并以廣陳皮為基礎(chǔ)對(duì)不同產(chǎn)地的陳皮及柑橘屬常用藥用植物進(jìn)行分析。方法：應(yīng)用硅膠GF254高效預(yù)制薄層板，揮發(fā)油成分以石油醚-三氯甲烷(2∶8.5)為展開劑展開，噴以5%的香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，日光下觀察；黃酮類成分以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(10∶1.7∶1∶0.5)和甲苯-乙酸乙酯(5∶5)為展開劑，二次展開，噴以5%三氯化鋁乙醇液，置于365 nm下檢視。將顯色后的薄層色譜圖導(dǎo)入CHROMA P1.5色譜指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件生成共有模式，進(jìn)行測試分析。結(jié)果：廣陳皮揮發(fā)油成分和黃酮類成分薄層色譜指紋圖譜分別由9個(gè)色譜峰組成，柑橘屬常用藥用植物之間在兩種成分上存在較大差異。結(jié)論：該方法可以快速、有效地對(duì)廣陳皮及其同屬藥用植物進(jìn)行鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

廣陳皮；柑橘屬；揮發(fā)油；黃酮；高效薄層色譜指紋圖譜

陳皮是蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮[1]，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”，其中以廣陳皮的質(zhì)量為優(yōu)。廣陳皮正品來源為茶枝柑Citrusreticulata‘Chachi’的皮，主產(chǎn)于廣東新會(huì)[2]。陳皮具理氣健脾、燥濕化痰的功能，用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多[3]。廣陳皮的有效成分為揮發(fā)油和黃酮類，研究報(bào)道，黃酮類以橙皮苷含量最高，其次為川陳皮素和橘皮素[4]。市場上一直存在陳皮與廣陳皮代用的狀況，為了正確評(píng)價(jià)廣陳皮的質(zhì)量，本研究建立了廣陳皮揮發(fā)油成分和黃酮類成分高效薄層色譜指紋圖譜，以采自廣東省新會(huì)的陳皮為對(duì)照藥材，建立薄層色譜指紋圖譜共有模式，考察了不同來源廣陳皮指紋圖譜的特征；并對(duì)廣陳皮近緣種常用藥用植物進(jìn)行研究，為廣陳皮及其近緣種藥用植物的鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供簡便、有效的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

硅膠GF254高效預(yù)制薄層板(Merck)，SP-20E型全自動(dòng)點(diǎn)樣儀(上海科哲生化科技有限公司)，雙槽層析缸，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，TH-Ⅱ型薄層加熱器(上海科哲生化科技有限公司)，WFH-201B紫外透射反射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，IX-US50型數(shù)碼相機(jī)(Canon公司)，CHROMA P1.5色譜指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件( 珠海科曼中藥研究有限公司)。試劑均為分析純。

1.2 對(duì)照品

月桂烯、橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素(上海源葉生物科技有限公司)，純度均大于98%。

1.3 樣品

藥材收集于廣東、四川、浙江等省，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)丁平研究員鑒定其種類，詳見表1，憑證存放于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室。

表1 陳皮及近源種藥材來源信息表

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取月桂烯用甲醇按1∶10的比例稀釋；精密稱取橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素，分別加甲醇配制成1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 揮發(fā)油供試品的制備 按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)一部附錄XD的方法提取，取廣陳皮及其近緣種藥材粗粉約30 g，加水300 mL，浸漬30 min，微沸4 h得揮發(fā)油。揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，用甲醇按1∶10的比例定容，即得。

2.2.2 黃酮類供試品的制備 稱取粉末約2 g，加石油醚100 mL，于85 ℃用索氏提取器提3 h；藥渣揮干，加80%乙醇100 mL，85 ℃回流3 h，過濾，揮干濾液，加甲醇定容至25 mL，即得。

2.3 薄層色譜條件

2.3.1 揮發(fā)油成分 精密取2.1項(xiàng)制備的月桂烯對(duì)照品溶液1 μL和2.2.1項(xiàng)制備的供試品溶液6 μL點(diǎn)于硅膠GF254高效預(yù)制薄層板上，條帶寬7 mm，點(diǎn)樣速度5 μL·min-1，以石油醚-三氯甲烷(2∶8.5)為展開劑，在25 ℃左右，相對(duì)濕度47%條件下展開，展距8 cm，取出，揮干溶劑，噴以5%的香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，日光下觀察。

2.3.2 黃酮成分 精密取2.1項(xiàng)制備的橙皮苷、橘皮素、川陳皮素對(duì)照品溶液5、5、1 μL和2.2.2項(xiàng)制備的廣陳皮對(duì)照藥材和不同商品來源廣陳皮供試品溶液5 μL點(diǎn)于硅膠GF254高效預(yù)制薄層板上；精密取2.1項(xiàng)制備的橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陳皮素對(duì)照品溶液各5、5、5、1 μL和2.2.2項(xiàng)制備的廣陳皮對(duì)照藥材及近緣種藥材供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于硅膠GF254高效預(yù)制薄層板上。在25 ℃左右環(huán)境下，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(10∶1.7∶1∶0.5)展開約4 cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯(5∶5)展開8 cm，取出晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇液，用熱風(fēng)微吹，置于365 nm下檢視。

2.4 薄層色譜指紋圖譜的測定

廣陳皮薄層色譜指紋圖譜見圖1、圖3，同屬常用藥用植物薄層色譜指紋圖譜見圖2、圖4。揮發(fā)油成分對(duì)照品的Rf值：月桂烯(Rf≈0.9)；黃酮成分對(duì)照品的Rf值分別為：橙皮苷(Rf≈0.2)、柚皮苷(Rf≈0.2)、川陳皮素(Rf≈0.58)、橘皮素(Rf≈0.63)。

注：S.月桂烯對(duì)照品；1.廣陳皮對(duì)照藥材；2～10.不同批次的商品廣陳皮。圖1 不同商品來源廣陳皮揮發(fā)油成分薄層色譜指紋圖譜

注：S.月桂烯對(duì)照品；1.廣陳皮對(duì)照藥材；11.川陳皮；12.浙江陳皮；13.江西陳皮；14.安徽陳皮；15.青皮；16.四川枳殼；17.毛橘紅；18.香櫞；19.廣佛手；20.檸檬。圖2 廣陳皮及其近緣種藥用植物揮發(fā)油成分薄層色譜指紋圖譜

注：S.對(duì)照品(a：橘皮素、b：川陳皮素、c：橙皮苷)；1.廣陳皮對(duì)照藥材；2～10.不同商品來源廣陳皮。 圖3 不同商品來源廣陳皮黃酮成分薄層色譜指紋圖譜

注：S.對(duì)照品(a：橘皮素、b：川陳皮素、c：橙皮苷、d：柚皮苷)；1.廣陳皮對(duì)照藥材；11.川陳皮；12.浙江陳皮；13.江西陳皮；14.安徽陳皮；15.青皮；16.四川枳殼；17.毛橘紅；18.香櫞；19.廣佛手；20.檸檬。圖4 廣陳皮及其近緣種藥用植物黃酮成分薄層色譜指紋圖譜

2.5 廣陳皮指紋圖譜共有模式的建立

將顯色后的薄層色譜圖導(dǎo)入CHROMA P1.5色譜指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件，對(duì)揮發(fā)油成分和黃酮類成分分別進(jìn)行白光和紫外掃描并積分。將廣陳皮對(duì)照藥材(1號(hào)樣品)數(shù)據(jù)采用中位數(shù)法確定特征峰，揮發(fā)油成分共指認(rèn)9個(gè)特征峰，其中9號(hào)峰為月桂烯，共同構(gòu)成廣陳皮揮發(fā)油薄層色譜指紋圖譜共有模式(見圖5)；黃酮類成分共指認(rèn)9個(gè)峰，其中3號(hào)峰為橙皮苷，7號(hào)峰為川陳皮素，8號(hào)峰為橘皮素，共同構(gòu)成廣陳皮黃酮類成分薄層色譜指紋圖譜共有模式(見圖6)。

圖5 廣陳皮揮發(fā)油成分指紋圖譜共有模式

圖6 廣陳皮黃酮類成分指紋圖譜共有模式

3 結(jié)果

3.1 薄層色譜指紋圖譜方法學(xué)考察

3.1.1 穩(wěn)定性考察 取同一批次的供試品溶液，分別于0、6、12、24、48 h點(diǎn)樣，色譜結(jié)果基本一致，比較色譜斑點(diǎn)Rf值，揮發(fā)油成分主要色譜斑點(diǎn)Rf值的RSD在0.91%～3.24%，黃酮類成分主要色譜斑點(diǎn)Rf值的RSD在1.76～2.68%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)均穩(wěn)定。

3.1.2 儀器精密度考察 取同一批次的供試品溶液，在同塊薄層板上連續(xù)點(diǎn)樣5次，色譜結(jié)果基本一致，比較色譜斑點(diǎn)的Rf值，主要色譜斑點(diǎn)Rf值的RSD在0.71%～3.93%。

3.1.3 重復(fù)性考察 取同一批次的藥材樣品5份，按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，色譜結(jié)果基本一致，比較色譜斑點(diǎn)的Rf值，揮發(fā)油成分主要色譜斑點(diǎn)Rf值的RSD在0.59%～4.09%，黃酮類成分主要色譜斑點(diǎn)Rf值的RSD在1.25～3.21%，表明建立的方法有良好的重復(fù)性。

3.2 廣陳皮薄層色譜指紋圖譜共有模式的建立

廣陳皮揮發(fā)油成分薄層色譜指紋圖譜共有模式有9個(gè)峰組成，其中9號(hào)峰為月桂烯；黃酮類成分共有模式有9個(gè)峰組成，3號(hào)峰為橙皮苷、7號(hào)峰為川陳皮素，8號(hào)峰為橘皮素，可用于廣陳皮的鑒定。

3.3 不同商品來源廣陳皮高效薄層指紋圖譜的比較

將9批廣陳皮薄層色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)與廣陳皮對(duì)照藥材相比，揮發(fā)油成分相似度均大于0.75，2、3、4、7、8號(hào)樣品相似度大于0.9，9、10號(hào)樣品相似度低于0.8；黃酮類成分相似度分散在0.5～0.95，2、3、4號(hào)樣品相似度大于0.9。說明市售廣陳皮質(zhì)量存在一定差異。見圖7、8。

圖7 不同商品來源廣陳皮揮發(fā)油成分相似度比較

圖8 不同商品來源廣陳皮黃酮成分相似度比較

3.4 廣陳皮近緣種藥用植物指紋圖譜的測定與評(píng)價(jià)

比較不同產(chǎn)地陳皮及常用柑橘屬藥用植物和廣陳皮對(duì)照藥材薄層色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)的差異，揮發(fā)油成分中浙江、江西、安徽陳皮和毛橘紅與對(duì)照藥材相似度在0.9以上，川陳皮、枳殼、香櫞、廣佛手與對(duì)照藥材相似度在0.75～0.9，青皮和檸檬相似度0.5左右；黃酮類成分中，佛手和檸檬與對(duì)照藥材相差最遠(yuǎn)，其余近緣種藥用植物相似度在0.4～0.7。這說明柑橘屬常用藥用植物不同化學(xué)成分間存在較大差異。見圖9、10。

3.5 廣陳皮及其近緣種藥用植物聚類分析

對(duì)不同產(chǎn)地的陳皮及柑橘屬常用藥用植物采用聚類分析法進(jìn)行分析，見圖11、12。從揮發(fā)油和黃酮類兩種成分的聚類樹狀圖中可以看出，廣陳皮與其近緣種藥用植物相差較大；浙江、安徽、江西陳皮可大致歸為一類；川陳皮的揮發(fā)油成分可以和枳殼歸為一類，而與青皮相差較遠(yuǎn)，其黃酮類成分可以和青皮歸為一類，而與枳殼相差甚遠(yuǎn)。柑橘屬藥用植物存在較大差異，均分為不同的類。

圖9 陳皮及常用柑橘屬藥用植物揮發(fā)油成分相似度比較

圖10 陳皮及常用柑橘屬藥用植物黃酮成分相似度比較

圖11 陳皮及常用柑橘屬藥用植物揮發(fā)油聚類樹狀圖

圖12 陳皮及常用柑橘屬藥用植物黃酮聚類樹狀圖

4 討論

廣陳皮主要有效成分為揮發(fā)油和黃酮類。本實(shí)驗(yàn)所用展開劑經(jīng)過篩選，最終廣陳皮揮發(fā)油成分采用石油醚—三氯甲烷(2∶8.5)展開系統(tǒng)，在薄層色譜圖上得到豐富且分離度好的斑點(diǎn)，此條件也適合同屬藥用植物。廣陳皮黃酮類成分極性相差較大，不易分離，采用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(10∶1.7∶1∶0.5)和甲苯-乙酸乙酯(5∶5)二次展開系統(tǒng)，可以很好地將黃酮類主要成分分離，應(yīng)用于同屬藥用植物中分離效果較理想。與文獻(xiàn)[5-8]中使用的廣陳皮薄層色譜條件相比較，本研究建立的色譜條件下的圖譜斑點(diǎn)豐富、清晰、重現(xiàn)性好。由于橙皮苷和柚皮苷極性極其相近，本實(shí)驗(yàn)條件下此兩種成分Rf相近導(dǎo)致斑點(diǎn)有重疊。

本研究發(fā)現(xiàn)不同商品來源的廣陳皮質(zhì)量存在一定差異，其中黃酮類成分差異性較揮發(fā)性成分大。2～8號(hào)樣品為生藥材，其揮發(fā)油成分與對(duì)照藥材的相似度在0.85以上，9、10號(hào)為炮制品，其相似度在0.75～0.8。文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]陳皮炮制后揮發(fā)油的含量和成分都有所下降，而本研究中炮制品的斑點(diǎn)較對(duì)照藥材斑點(diǎn)豐富，這是炮制過程還是炮制所用生藥材不同導(dǎo)致的，有待進(jìn)一步研究。不同商品來源的廣陳皮黃酮類成分的比較，2、3、4號(hào)樣品與對(duì)照藥材的相似度大于0.9，而5～10號(hào)樣品相似度較低，介于0.5～0.9，有研究報(bào)道采收時(shí)間和產(chǎn)地是影響廣陳皮藥材質(zhì)量的重要因素，特別是川陳皮素和橘皮素的含量受這兩個(gè)因素的影響較大[11]，這也可能是導(dǎo)致不同商品來源廣陳皮黃酮類成分間差異較大的原因。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，2、3、4號(hào)樣品揮發(fā)油成分相似度在0.9以上，其性狀均為三瓣，并且在揮發(fā)油提取過程中發(fā)現(xiàn)，完整瓣?duì)顝V陳皮較絲狀廣陳皮總揮發(fā)油的量更多，提取時(shí)間更短，而市售藥材多為絲狀，建議陳皮藥材在加工時(shí)不要切絲。文獻(xiàn)報(bào)道貯存時(shí)間越長則陳皮中揮發(fā)油的含量逐漸降低，橙皮苷的含量逐漸增多，不同的炮制方法對(duì)陳皮化學(xué)成分的影響也不同[12]。因此，從產(chǎn)地、采收、加工、貯存等方面嚴(yán)格控制對(duì)提高廣陳皮的質(zhì)量有重要意義。

從分析結(jié)果看，廣陳皮不可與同屬藥用植物歸為一類，浙江、安徽、江西陳皮可大致歸為一類，川陳皮和四川枳殼在某些成分上可歸為一類，這些歸類與按地理區(qū)域劃分相吻合。市場上常存在同屬一些藥用植物代用、混用的狀況，陳皮代替廣陳皮入藥更是常見。本研究中雖然發(fā)現(xiàn)浙江、安徽、江西陳皮和廣陳皮的揮發(fā)性成分相似，但其黃酮類成分相差較遠(yuǎn)，這必將導(dǎo)致療效的差異，建議不要用陳皮代替廣陳皮入藥；川陳皮與廣陳皮揮發(fā)性成分相似度在0.85左右，黃酮類成分相似度在0.6以下，說明兩者的有效成分存在較大的的差異，依靠薄層色譜指紋圖譜可以將兩者區(qū)分開。香櫞原植物為香櫞和枸櫞，佛手為枸櫞的變種，在廣東臨床上常以佛手代替枸櫞[13]，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出藥材佛手和香櫞的化學(xué)成分存在較大差異，因此佛手不可代替香櫞入藥。本研究方法可快速、準(zhǔn)確地鑒別陳皮及其近緣種常用藥用植物。

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HPTLCFingerprintAnalysisofCitrusreticulata‘Chachi’andItsRelatedSpecies

GAOJunli，SHAOYanhua，LIQian，ZHANGRunjing，DINGPing*

(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objective：To establish the high-performance thin layer chromatographic (HPTLC) fingerprints of volatile oil and flavonoids inCitrus.reticulata‘Chachi’，and compare fingerprints similarity with its related species，such asC.reticulataBlanco from various habitats，etc.Methods：The separation was performed on the pre-coated HPTLC GF254silica-gel plate.The volatile oil was developed with solvent system of petroleum ether-chloroform (2∶8.5)，5% vanillic aldyhyde and oil of vitriol reagent as color development reagent.The flavonoids compounds used second outspread system that ethyl acetate-methanol-water-formic acid (10∶1.7∶1∶0.5) as the first system and toluene-ethyl acetate (5∶5) as the second，and 5% aluminium chloride ethanol solution as color development reagent which needed to be observed in 365 nm.The common patterns of HPTLC fingerprints were obtained through (CHROMAP1.5) solution software，and authentication and quality assessment were analyzed by similarity and Principle Component Analysis.Results：The common patterns of the volatile oil and the flavonoids consisted of 9 characteristic peaks respectively，in these two compounds，there were significant differences among the fingerprints ofCitruscommonly used medicines.Conclusion：This method is simple and rapid，which can serve as an effective identification and quality assessment method forC.reticulata‘Chachi’ and its related species.

Citrus.reticulata‘Chachi’；volatile oil；flavonoids；thin-layer chromatography

2015-01-23)

*

丁平，研究員，研究方向：中藥資源有效成分及其質(zhì)量評(píng)價(jià)；E-mail：dingpinggz@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.006