長春花生物堿類化合物液相色譜/四級桿-飛行時間質譜分析△

于海川，趙杰，吳嬌*，侯貝貝，臧楠，仝溫溫

(1.新鄉醫學院 醫學檢驗學院，河南 新鄉 453003；2.河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心，河南 新鄉 453003；3.新鄉醫學院 藥學院，河南 新鄉 453003)

·基礎研究·

長春花生物堿類化合物液相色譜/四級桿-飛行時間質譜分析△

于海川1,2，趙杰3，吳嬌3*，侯貝貝3，臧楠1，仝溫溫1

(1.新鄉醫學院 醫學檢驗學院，河南 新鄉 453003；2.河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心，河南 新鄉 453003；3.新鄉醫學院 藥學院，河南 新鄉 453003)

目的：建立一種長春花生物堿類化合物的液相色譜/四級桿-飛行時間質譜分析方法。方法：本研究采用大孔吸附樹脂柱法富集長春花葉中的生物堿類化合物，經Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm× 3 mm，1.8 μm)，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，對長春花生物堿類化合物進行分離。結果：采用正離子電噴霧-飛行時間質譜法測定精確分子量，并結合標準品對照快速鑒定出15個生物堿類化合物。結論：該方法結合了液相色譜的高分離效能與高分辨質譜的準確性及選擇性，具有快速、穩定可靠的特點，可為長春花細胞培養工藝優化和質量控制提供參考。

長春花；生物堿；液相色譜/飛行時間質譜

長春花Catharanthusroseus(L.)G.Don為夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬Catharanthus植物長春花的全草，又稱雁來紅、日日新、四時春和三萬花等，是一種分布廣泛的藥用、觀賞植物[1]。長春花次生代謝產物相對豐富，從其中已分離鑒定出130多種萜類吲哚生物堿[2-4]，其中長春堿、長春新堿、長春質堿和文多靈是4種具有非常重要藥用價值的吲哚類生物堿。長春質堿、文多靈是合成長春堿的前體，長春堿和長春新堿已成為應用最為廣泛的兩種天然植物抗腫瘤藥物[5]；阿瑪堿和蛇根堿作為高效降壓藥于臨床上使用；文多靈、環氧長春堿和長春質堿被廣泛用于治療糖尿病等[6]。

長春花植物體中的長春堿和長春新堿僅有百萬分之幾或十萬分之幾，遠遠不能滿足臨床上對長春堿或長春新堿的特殊抗癌療效的需求。目前人們主要還是需要花費巨額成本從長春花植物體提取長春花生物堿類化合物。近三十年來，科學家希望通過長春花細胞培養，提高細胞中的長春堿或長春新堿含量，在不同植物器官的培養、培養條件優化[7]、添加代謝前體和誘導子[8]等方面做了大量工作。因此，針對長春花體內的多種具有重要藥用價值的萜類吲哚生物堿，建立一種快速、靈敏、高效、精準的檢測技術對長春花細胞培養條件優化和質量評價具有重要意義。

關于長春花次生代謝產物分析測定方法的已有報道，如薄層掃描法[9]、高效液相色譜法[10]及放射性免疫測定法[11]等。但采用聯用技術同時對多種長春花生物堿類化合物進行高、精、準的快速檢測尚未見報道。液質聯用技術是將液相的高分離效能與質譜的強大結構測定功能組合起來，為天然產物活性成分的快速分析提供了一個重要的新技術。四級桿/飛行時間質譜(Q-TOF MS)能提供精確質量數，通過精確的分子質量數的匹配能發現和鑒定化合物，特別是非特定的目標化合物[12]。

本試驗采用大孔吸附樹脂分離技術獲得長春花總生物堿，并運用液相色譜/飛行時間質譜(LC/TOF MS)聯用技術對該提取物進行化學成分分析，為長春花總生物堿的制備工藝和質量控制提供重要依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 SL型高分離度快速液相色譜/Agilent 6530型四級桿-飛行時間質譜儀；Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3 mm，1.8 μm)；臺式高速冷凍離心機(德國Hettich公司)。

1.2 材料

長春花樣品采集于云南省昆明市，憑證標本編號為CR130216，存放于新鄉醫學院藥學院。

2方法與結果

2.1 長春花總生物堿的制備

2.1.1 樹脂的預處理 稱量AB-8大孔樹脂2 Kg，加乙醇(濃度>95%)浸泡24 h，用2 BV乙醇，以1.5 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，并保持液面高度，最后保留一定量的乙醇，浸泡12 h。然后用2～4 BV水，以1.5 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色混濁為止。再用2 BV濃度為1 mol·L-1的鹽酸(HCl)溶液，以2 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，并浸泡2～4 h，用純水以同樣流速洗至流出液pH中性。加入2～3 BV濃度為1 mol·L-1的氫氧化鈉(NaOH)溶液，以2.0 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，用純水以同樣流速洗至流出液pH中性。取適量裝入玻璃色譜柱(40 cm×2.4 cm)。

2.1.2 洗脫條件 樣品上柱后依次用水、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液適量，進行洗脫，流量為8 mL·min-1。

2.1.3 樹脂再生 用80%乙醇水溶液2000 mL洗脫柱體至大孔吸附樹脂填料顏色為白色，再用4000 mL水洗至無乙醇味，分離柱即可重復使用。

2.1.4 長春花中總生物堿的提取 將采集的樣品經50 ℃烘干，粉碎，過60目篩，備用。取等量長春花樣品，用80%的甲醇浸泡，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮，加適量水稀釋后過濾，進行AB-8大孔樹脂吸附，然后用30%、50%、70%、90%乙醇水梯度洗脫。將70%乙醇水洗脫液減壓蒸干，稱重，用色譜純甲醇溶解定容，離心，取上清，微量移液槍取10 μL，定容至1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

2.2 長春花總生物堿液質聯用分析

2.2.1 供試品制備 稱取2.1.4所制得的長春花總生物堿20.0 mg，加入20 mL甲醇，振蕩20 min，于6000 r·min-1、低溫條件下離心10 min，取上清液，得到約20 mL甲醇溶液。將20 mL甲醇溶液旋轉蒸發濃縮后，用色譜甲醇定容至5 mL，過0.22 μm濾膜，待分析。

2.2.2 分析條件 色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3 mm，1.8 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脫程序為0 min 5% A，17 min 90% A，20 min 90% A，25 min 5% A；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量，5 μL；單個樣品運行時間為25 min。

質譜條件：ESI(+)，干燥氣為氮氣(N2)；溫度為350 ℃；流速為10 L·min-1；霧化氣壓力為241.325 KPa；鞘氣溫度為400 ℃，流速為12 L·min-1；毛細管電壓為3500 V；噴嘴電壓為0 V；碎裂電壓為75 V；離子掃描范圍m/z100～1000；正模式參比離子為121.0855、922.0922。

2.2.3 樣品分析 將供試品溶液放入自動進樣器中，按選定的測試條件進行檢測，得供試品的總離子流色譜圖，見圖1。

2.2.4 總離子流色譜圖中化合物的鑒定 根據飛行時間質譜所測定的[M+H]+值及質譜圖譜，通過將LC-TOF-MS檢測到的化合物的精確分子量試驗值與理論值進行匹配，計算其誤差，對誤差<10 ppm的化合物在ChemSpider database、PubChem Compound Database和Dictionary of Natural Products等軟件中進行匹配和檢索，鑒定出15個化合物，結果見表1。

圖1 長春花生物堿類化合物的總離子流色普圖

表1 長春花生物堿類化合物的LC/ESI-TOF MS分析結果

3 討論

本文首次運用LC/Q-TOF MS聯用技術對長春花生物堿類化合物進行分析研究，根據質譜和精確分子量，通過參考長春花化學成分研究的文獻[3]、檢索天然產物數據庫等方法，鑒定出乙醇提取物中的15個生物堿類化合物。

ESI源霧化室噴嘴電壓的大小會影響進入毛細管之前的液滴的帶電情況，當毛細管電壓為3500 V時，設置噴嘴電壓為0 V，使兩者之間的壓力差為最大值，有利于所有液滴帶電，這樣進入毛細管的離子數量達到最多，從而實現無歧視檢測所有小分子代謝物的信息；當設置噴嘴電壓為800 V時，幾乎檢測不到樣品中的離子信息。根據安捷倫噴射離子流聚焦技術，在霧化氣周圍添加同軸鞘氣，并通過提高電噴霧帶電液滴的空間聚焦來提高MS的靈敏度，進而提高離子化效率和去溶劑化效率。將進入毛細管之前的離子束進行壓縮，達到減少離子擴散、引入更多離子到毛細管中、減少中性溶劑束進入質譜、降低噪音、提高靈敏度的目的。鞘氣溫度與鞘氣流速有關，合適的溫度為400 ℃，流速為12 L·min-1。

LC-TOF/MS采用高純氮氣作為干燥氣，用于對霧化后的液滴進行干燥，其溫度的高低和流速大小對分析結果有一定的影響。此外，干燥氣溫度與溶劑的蒸汽壓有關，蒸汽壓越低的溶劑所需干燥氣的溫度就越高，推薦干燥氣流速宜設為6～12 L·min-1，溫度宜設為300～350 ℃。本研究根據長春堿、長春新堿和文多靈對照樣品的出峰情況，在適宜范圍內調節后，根據參考文獻設置干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為9 L·min-1。

通過采用液質聯用技術快速檢出長春花生物堿類化合物，對長春花細胞培養工藝進行合理地指導和優化，為其質量控制提供參考。

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LC/Q-TOF MS Analysis of Alkaloids fromCatharanthusroseus

YU Haichuan1,2，ZHAO Jie3，WU Jiao3*，HOU Beibei3，ZANG Nan1，TONG Wenwen1

(1.School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China;2.Henan Collaborative Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine, Xinxiang 453003, China;3.School of Pharmacy, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective：The study is aimed to identify the alkaloids ofCatharanthusroseuby LC/Q-TOF MS.Methods：An Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm× 3 mm，1.8 μm)column was used for the separation of the related substances with a mixture of acetonitrile and 0.1% formic acid buffer solution as the mobile phase by gradient elution.Results：The alkaloids were speculated by electrospray positive ionization LC-TOF/MS accurate ion mass，and verified further through standard substances determination.Alkaloids were separated under the established HPLC condition.Fifteen related alkaloids were characterized.Conclusion：The LC-MS method is useful for the identification of the alkaloids ofC.roseuand the results obtained are valuable for its manufacturing process and quality control.

Catharanthusroseus；alkaloids；LC/Q-TOF MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.009

2015-01-22)

國家自然科學基金項目(31301135)；河南省教育廳重點課題(13B350215/14B320015)；新鄉醫學院高層次人才科研啟動項目(100403/505002)；新鄉醫學院科研培育基金(2014QN150)；國家級大學生創新訓練項目(201310472054/201310472055)

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吳嬌，副教授，博士，研究方向：中藥和天然藥物的生物活性及其作用機理研究；Tel：(0373)3831981，E-mail：wujiao@xxmu.edu.cn