桑葉中黃酮類和酚酸類成分的提取工藝優化△

李君，季濤，宿樹蘭，錢大瑋

(南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

·中藥工業·

桑葉中黃酮類和酚酸類成分的提取工藝優化△

李君，季濤，宿樹蘭*，錢大瑋

(南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心，江蘇 南京210023)

目的：對桑葉中黃酮類和酚酸類的提取工藝進行優化，以期為該類化學成分的資源化利用提供參考。方法：采用乙醇溶劑提取桑葉中黃酮類和酚酸類成分；采用正交試驗對提取工藝參數進行優化；采用HPLC-DAD方法對其中3個黃酮類化學成分和3個酚酸類成分進行分析評價。結果：各因素對黃酮類成分提取率影響的程度排序為乙醇濃度>料液比>提取時間>提取次數；各因素對酚酸類成分提取率影響的程度排序為提取時間>提取次數>料液比>乙醇濃度。通過HPLC-DAD分析其中6個資源性化學成分的評價結果及方差，黃酮類、酚酸類成分的最佳提取工藝參數：乙醇濃度為85%，料液比為1∶40，提取時間為45min，提取次數為3次。結論：該提取工藝流程簡單，提取率高，可為桑葉資源的開發利用提供參考。

桑葉；黃酮類；酚酸類；正交試驗；提取工藝

桑葉為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉，其性寒，味甘苦，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功能，臨床上主要用于降血糖、降血脂等。現代研究表明，桑葉中主要含有黃酮類、生物堿類、多糖類成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗衰老、抗氧化等多種生理活性[1-2]。此外，桑葉中還含有植物甾醇類、微量元素類、維生素類、氨基酸類等成分[3-4]。大量研究表明，桑葉降血糖作用與黃酮類、多糖類、生物堿類化合物密切相關[5-8]，黃酮類是其降糖主要有效成分之一。桑葉中黃酮類化合物約占桑葉干重的1%～3%，其中包括以槲皮素為母核的黃酮類成分如槲皮素(quercetin)、桑苷(tutin)、蘆丁(rutin)、異槲皮素(quercitrin)等；以山柰酚為母核的黃酮類成分如山柰酚(kaempferol)、紫云英苷(astragalin)等。桑葉中的有機酸類成分主要包括綠原酸(Chlorogenic acid)、新綠原酸(Neochlorogenic acid)、隱綠原酸(Cryptochlorogenic acid)等。Hunyadi A等[9]研究表明，桑葉中綠原酸成分具有降血糖作用。

筆者在相關文獻報道的基礎上[10-16]，對桑葉中黃酮類和酚酸類成分的提取工藝參數進行優化研究，通過正交試驗、方法學考察，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)同時分析評價桑葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮素和紫云英苷6種活性成分，明確了桑葉黃酮類和酚酸類成分的最佳提取工藝參數，以期為桑葉中該類資源性化學成分的開發利用提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695 Alliance高效液相色譜系統(四元泵溶劑系統、在線脫氣機和自動進樣器)；Sartorius BT125D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KH-500DV超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；Anke LXJ-IIB型離心機(上海安亭科學儀器廠)；EPED超純水系統(南京易普易科技發展有限公司)；PMB 53型快速水分測定儀(上海珂淮儀器有限公司)。

干燥桑葉購自安徽藥材市場，經鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉片。蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為LGNR-5N9L，Y-076-120325，Z-020-120312，110753-201314，MUST-14043010，MUST-14041410)；乙腈(色譜純)；乙醇(南京化學試劑有限公司)；超純水為實驗室自制。

2 方法

2.1正交試驗設計

考察了乙醇溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(D)4項因素，每項因素選用3個水平，以黃酮類和酚酸類成分含量為考察指標，采用L9(34)正交表安排試驗，并對結果進行方差分析。

2.2提取方法

桑葉粉碎至粉末，精密稱重3.0g，按表1所設計的試驗條件，采用乙醇溶劑回流提取，過濾，離心濃縮，過濾膜，進行高效液相分析。

表1 桑葉黃酮和酚酸類正交試驗因素水平表

2.3色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLCBEH(100mm×2.1mm，1.7μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)，乙腈(B)，梯度洗脫(0～10min13%A；10～15min13%A；15～18min13%～20%A；18～43min20%A；43～45min20%～10%A)；流速：0.8mL·min-1；柱溫：30℃；進樣體積：10μL。

注：A.混合對照品；B.樣品；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.蘆丁；5.異槲皮素；6.紫云英苷。圖1 桑葉中黃酮類和酚酸類成分(6種)的HPLC圖

2.4方法學考察

2.4.1標準曲線 按2.3項下色譜條件測定，以對照品的質量濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行回歸處理，得線性回歸方程，蘆丁：Y=2×109X-310 474(r=0.999 9)，線性范圍為11.9～238 μg·mL-1；異槲皮素：Y=3×109X-424 299(r=1)，線性范圍為14.3～286 μg·mL-1；紫云英苷：Y=4×109X-84 185(r=0.999 7)，線性范圍為22.2～444 μg·mL-1；新綠原酸：Y=2×109X+4×106(r=0.999 6)，線性范圍為19.3～334 μg·mL-1；綠原酸：Y=2×109X+4×106(r=0.999 0)，線性范圍為19.3～540 μg·mL-1；隱綠原酸：Y=2×109X+8×106(r=0.999 1)，線性范圍為32～438 μg·mL-1。

2.4.2 精密度試驗 移取蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品溶液，依照2.3項下色譜條件連續進樣6次，以峰面積進行精密度考察，RSD分別為1.2%、0.9%、1.0%、1.1%、0.7%、0.9%(n=6)，表明精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 稱取桑葉樣品6份，每份約1 g，精密稱定，分別制備供試品溶液，依照2.3項下條件進樣分析，蘆丁、異槲皮素、紫云英苷所對應的色譜峰面積的RSD分別為2.06%、0.47%和0.86%，說明所建立的液相分析方法重復性好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，以蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣，進行穩定性考察。結果表明，RSD分別為0.1%、0.4%、0.2%、0.6%、0.2%、0.4%(n=7)，說明提取的各組分在12 h內穩定性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的桑葉樣品6份，各約1.0 g，精密稱定，分別按已知濃度的80%、100%、120%加入蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、綠原酸、隱綠原酸以及新綠原酸對照品，制備相應的供試品溶液，并依照2.3項下色譜條件進樣分析，并按標準曲線法計算含量、加樣回收率及RSD值。蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、綠原酸、隱綠原酸以及新綠原酸的加樣回收率分別為95.2%、96.4%、93.6%、92.4%、95.1%、97.4%，RSD值分別為1.1%、1.6%、1.9%、2.1%、1.7%、1.9% 。

3 分析結果

試驗結果見表2～6。由表2～6可看出，乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數對黃酮類和酚酸類成分提取影響程度不同。對黃酮類成分而言，各因素對提取率影響程度排序為乙醇濃度>料液比>提取時間>提取次數；各因素對酚酸類提取率影響程度排序為提取時間>提取次數>料液比>乙醇濃度。黃酮類成分的最佳提取工藝為A3B2C2D3；酚酸類成分的最佳提取工藝為A1B2C2D3。正交結果和方差分析結果表明，A3條件下黃酮類成分提取率明顯優于其他參數，D3條件下酚酸類成分提取率明顯優于其他參數，且差異均具有統計學意義。綜合分析，確定桑葉黃酮類和酚酸類成分的最佳提取工藝參數為A3B2C2D3組合，即料液比為1∶40，85%乙醇回流提取45 min，提取3次。不同因素水平條件下，桑葉中黃酮類和酚酸類成分的含量見表4。

表2 L9(34)正交試驗黃酮類成分分析結果

表3 方差分析

4 最佳提取工藝的驗證試驗結果

稱取3份桑葉，各3 g，按正交試驗設計優化得到的工藝條件進行提取試驗，測定桑葉黃酮類和酚酸類成分含量。結果桑葉黃酮類成分質量分數分別為1.130、1.101、1.123 mg·g-1；酚酸類成分質量分數分別為3.821、3.798、3.810 mg·g-1，與正交試驗最佳工藝組數據吻合，表明該最佳工藝提取桑葉黃酮類和酚酸類成分含量高，工藝穩定，結果可信。

表4 L9(34)正交試驗酚酸類成分分析結果

表5 方差分析

表6 正交試驗6種資源性化學成分的分析結果

5 結論與討論

本文通過正交試驗和驗證試驗，優化桑葉黃酮類和酚酸類成分的提取工藝參數。研究表明，桑葉黃酮類成分提取的影響因素排序為料液比>乙醇濃度>提取時間>提取次數；酚酸類成分提取的影響因素排序為提取次數>提取時間>料液比>乙醇濃度。但兩類成分最佳工藝參數一致，均為料液比1∶40，85%乙醇回流提45 min，提取3次。

本試驗采用HPLC-DAD分析方法同時測定桑葉中3種黃酮類和3種酚酸類成分，為建立桑葉多指標的質量評價模式提供參考。中藥成分的復雜性決定了采用單一成分和指標來評價其質量具有較大的片面性，因此亟需建立多成分質量控制的評價模式。國內外對于桑葉活性成分的提取主要集中在總黃酮、生物堿和多糖成分的研究上[17-19]，而對于酚酸類成分的提取報道較少。本文建立的同時分析測定黃酮類與酚酸類資源性化學成分的HPLC-DAD分析方法，為桑葉及其制劑產品的質量控制，以及桑葉資源的開發利用提供了方法學參考和技術支撐。

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ExtractionOptimizationofFlavonoidsandPhenolicAcidsfromMulberryLeaves

LIJun，JITao，SUShulan*，QIANDawei

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：The study is aimed to optimize the extract parameters of flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves in order to provide the basis for the resource utilization.Method：The ethanol solvent was selected to extract the flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves.And the extraction parameters were optimized by orthogonal experiment and HPLC-DAD method was adopted to analyze the flavonoids and phenolic acids.Results：The results showed that the influence degree of various factors for flavonoids is：ethanol concentration>ratio of material to liquid>extraction time>extraction frequency.For phenolic constituents，the extraction frequency>extraction time>ratio of material to liquid>ethanol concentration.Based on the six bioactive compositions and variance analysis data，the optimal parameters of the extraction for flavonoids and phenolic acids were：ethanol concentration85%，ratio of material to liquid was1∶40，extraction time is45minutes，3times of extraction，respectively.Conclusion：The extraction process of flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves has the advantages of simplicity，high extraction rate，and it provides the basis and reference for the development and utilization of mulberry resources.

Mulberry leaves；flavonoids；phenolic acids；orthogonal experiment；extraction optimization

國家自然科學基金項目(81373889，30973885)；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目(NCET-13-0873)

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宿樹蘭，副教授，研究方向：中藥資源與利用；Tel：(025)85811916，E-mail：sushulan@njutcm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.020

2014-10-31)