中藥材DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展△

辛天怡，雷美艷，宋經(jīng)元,*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435)

·綜述·

中藥材DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展△

辛天怡1，雷美艷2，宋經(jīng)元1,2*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435)

DNA條形碼技術(shù)給中藥鑒定學(xué)發(fā)展帶來新的機(jī)遇，中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫及中草藥DNA條形碼生物鑒定體系的創(chuàng)建有利于推進(jìn)中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化和國際化。中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國藥典》2010版第三增補(bǔ)本，為中藥材基原物種鑒定提供強(qiáng)有力的科技支撐，將在中藥材及中成藥流通監(jiān)管、道地藥材鑒別、保健食品和食品質(zhì)量安全控制等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。將中藥材DNA條形碼分子鑒定法與中國藥典規(guī)定的其他鑒別方法相結(jié)合，能夠?qū)λ幤焚|(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)與有效監(jiān)控。

中藥材；DNA條形碼；鑒定；ITS2；psbA-trnH；COI

自2003年P(guān)aul Hebert首次提出“DNA條形碼”概念[1]，至今已逾10年。DNA條形碼分子鑒定技術(shù)走過了從無到有再到飛速發(fā)展的歷程。Miller稱DNA條形碼技術(shù)推動了分類學(xué)的“文藝復(fù)興”[2]，能夠給日漸萎縮的傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)帶來新的發(fā)展機(jī)遇。如今，DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于不同行業(yè)，針對不同研究對象和內(nèi)容，均有相關(guān)研究項(xiàng)目和工作組對中藥鑒定學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、發(fā)育進(jìn)化、生態(tài)學(xué)、生物多樣性保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域展開研究[3]。研究者認(rèn)為該技術(shù)能夠有效監(jiān)控珍稀瀕危物種進(jìn)出口貿(mào)易，在中藥材流通領(lǐng)域及食品藥品監(jiān)督管理等方面發(fā)揮巨大作用[4]。由于傳統(tǒng)鑒定方法在中藥材物種鑒定上存在局限性，為保證中藥材臨床用藥的安全、有效性，有必要采用新技術(shù)新方法對其進(jìn)行補(bǔ)充，中藥材DNA條形碼分子鑒定法[5-6]為中藥材基原物種的鑒定提供了強(qiáng)有力的科技支撐。本文對DNA條形碼技術(shù)在中藥材鑒定及相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對該技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 中藥材DNA條形碼分子鑒定研究進(jìn)展

為解決中藥行業(yè)對中藥材基原物種鑒定的需求，Chen等[7]基于大量實(shí)驗(yàn)樣本在國際上首先驗(yàn)證并確立ITS2序列作為藥用植物通用條形碼，并在川芎、蛇床、麥冬等藥材基原物種及其混偽品的鑒定工作中得到良好應(yīng)用[8-10]。基于DNA條形碼技術(shù)在藥用植物物種鑒定等的成功應(yīng)用，研究者將該技術(shù)應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大到中藥材。2014年Biotechnology Advances文章[11]以“DNA條形碼鑒定是草藥鑒定從形態(tài)到DNA的文藝復(fù)興”介紹了該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的中藥材DNA條形碼鑒定體系和數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫涵蓋中國、日本、韓國、印度、美國和歐洲藥典中記載的絕大部分藥材的DNA條形碼序列，對推進(jìn)中藥鑒定方法通用化、標(biāo)準(zhǔn)化和國際化具有重要作用。

1.1 中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則的確立

陳士林等[6]基于大樣本量實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建以ITS2序列為主要條形碼的中藥材DNA條形碼分子鑒定體系，并提出中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，其中植物類中藥材選用ITS2為主體序列，psbA-trnH為輔助序列；動物類中藥材采用COI為主體序列，ITS2為輔助序列，符合中藥材鑒定簡單、精確的特點(diǎn)，有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對中藥材及其基原物種的準(zhǔn)確鑒定。目前該指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國藥典》(2010版 第三增補(bǔ)本)[12]，主要用于規(guī)范中藥材DNA條形碼分子鑒定法，為其應(yīng)用提供指導(dǎo)，適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片)及其基原物種的鑒定，其流程如圖1所示。

圖1 中藥材DNA條形碼分子鑒定流程

1.2 中藥材DNA條形碼分子鑒定法應(yīng)用實(shí)例

2012年，辛天怡等[13]采用DNA條形碼分子鑒定技術(shù)對羌活藥材及其混偽品進(jìn)行研究，證實(shí)ITS/ITS2序列能夠穩(wěn)定、準(zhǔn)確區(qū)分羌活藥材及其混偽品，該研究為后續(xù)工作提供了新的思路。Hou等[14]對山茱萸的研究表明，DNA條形碼分子鑒定法能夠用于新鮮或自然干燥樣本的鑒定，而市售山茱萸藥材多采用文火烘或置沸水中略燙以去除果核，再行干燥，如此處理方法使得市售山茱萸藥材DNA降解嚴(yán)重，無法獲得滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基因組DNA，故DNA條形碼分子鑒定法不適用于市售山茱萸藥材的鑒定。該研究提示DNA條形碼分子鑒定法必須要在適宜范圍內(nèi)應(yīng)用，對于已經(jīng)過炮制加工(簡單切制、低溫干燥等除外)的飲片，此方法具有局限性。研究者已對中國藥典收載中藥材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究(表1列舉部分案例)，證實(shí)該方法的實(shí)用性價(jià)值，擴(kuò)充和完善中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，并將其逐漸應(yīng)用于實(shí)際鑒定工作當(dāng)中[15]。該方法能夠在中藥生產(chǎn)企業(yè)原料監(jiān)管、醫(yī)院藥房中藥材飲片真?zhèn)舞b定、中藥材流通領(lǐng)域、出入境檢驗(yàn)檢疫、海關(guān)中藥材進(jìn)出口管理與鑒定等方面發(fā)揮重要作用。

表1 中藥材DNA條形碼分子鑒定研究實(shí)例

2 DNA條形碼分子鑒定技術(shù)在中藥及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用前景

2.1 中成藥DNA條形碼分子鑒定

近年來中藥作為西藥的補(bǔ)充或替代在亞洲之外的應(yīng)用與日俱增[72]。中藥制品的日益普及使得該行業(yè)產(chǎn)值每年增加數(shù)百萬美元[73]，與此同時(shí)全球補(bǔ)充和替代藥物的使用也在增加。中醫(yī)處方通常包含不同動植物來源藥材，協(xié)同作用、相互影響以達(dá)到預(yù)期治療效果。方劑中不同藥材加工炮制方法的特殊性，所含成分的生物來源難以確定，均會導(dǎo)致有關(guān)中藥質(zhì)量、療效和安全性等方面的問題[74]。Newmaster等[75]對于北美12家公司44種草藥產(chǎn)品的檢測結(jié)果顯示大部分草藥產(chǎn)品均能夠獲得DNA條形碼序列(rbcL+ITS2序列)。59%的供試樣本中含有未在標(biāo)簽上列出的物種；68.2%的供試樣本中存在替代品；實(shí)驗(yàn)中涉及到的草藥產(chǎn)品多數(shù)質(zhì)量較差，含有大量替代品、雜質(zhì)或其他無藥用價(jià)值的填料；僅有2家公司的產(chǎn)品未檢出任何替代品。該研究表明DNA條形碼技術(shù)能夠用于北美草藥產(chǎn)品市場監(jiān)控，有助于監(jiān)督制藥企業(yè)為消費(fèi)者提供安全、優(yōu)質(zhì)的草藥產(chǎn)品。

目前基于DNA條形碼技術(shù)對中成藥進(jìn)行鑒定的相關(guān)報(bào)道較少，但已有研究者采用DNA分子鑒定技術(shù)對中成藥進(jìn)行鑒定。Cheng等[76]基于高通量測序技術(shù)和宏基因組數(shù)據(jù)分析等方法，對中成藥六味地黃丸物種組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同廠商生產(chǎn)的六味地黃丸物種組成上差異較大，影響其臨床療效。Coghlan等[77]基于高通量測序技術(shù)檢測包括散劑、片劑、膠囊劑、膽片和草藥茶等在內(nèi)的15種不同劑型的中成藥，共獲得超過49 000條trnL和16S rRNA序列，證實(shí)第二代高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing，HTS)是在基因?qū)用鏅z測復(fù)方中藥的有效方法。部分供試樣本中含有瀕危野生動植物物種國際貿(mào)易公約(CITES)中所收載的物種、潛在毒性/致敏性植物或未申明成分。序列比對結(jié)果顯示植物藥中含有68個(gè)不同科屬的植物，包括麻黃屬(Ephedra)、細(xì)辛屬(Asarum)等具有潛在毒性的屬種；動物藥中包含一些漸危、瀕危甚至極度瀕危的種屬，如亞洲黑熊(Ursusthibetanus)、賽加羚羊(Saigatatarica)。此外，許多供試品中檢測出含有一些極少在產(chǎn)品包裝上標(biāo)識的牛科(Bovidae)、鹿科(Cervidae)和蟾蜍科(Bufonidae)動物的DNA。該研究表明采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行深度測序是檢測中成藥的有效手段，植物DNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫的完善將有助于監(jiān)測中成藥的合法性和安全性。崔占虎等[78]基于psbA-trnH和rbcL序列，通過克隆技術(shù)對連翹敗毒丸中原料藥材進(jìn)行分子鑒別，結(jié)果顯示psbA-trnH序列能夠鑒定出連翹敗毒丸19種原料藥材中的9種，rbcL序列能夠鑒定出其中6種，二者一共能夠鑒定出10種藥材。由此可見，DNA條形碼技術(shù)在中成藥鑒定工作中運(yùn)用尚不廣泛，需要加強(qiáng)此方面的研究。

2.2 保健食品DNA條形碼分子鑒定

DNA條形碼分子鑒定技術(shù)除了發(fā)揮其在藥用植物及中藥材物種鑒定領(lǐng)域的優(yōu)勢之外，亦可嘗試將其應(yīng)用于保健食品鑒定工作中。食品質(zhì)量安全一直是消費(fèi)者及食品安全監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)，無論何種情況，食品質(zhì)量問題一旦被媒體報(bào)道出來，都會對輿論造成很大影響。為保證食品質(zhì)量，各國政府均依據(jù)本國實(shí)際情況制定有關(guān)食品生產(chǎn)及保藏的國家標(biāo)準(zhǔn)[79]。保健食品作為特殊食品，其質(zhì)量安全同樣極受關(guān)注。我國《保健食品注冊管理辦法(試行)》由國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布[80]，于2005年7月1日正式實(shí)施，該辦法對保健食品進(jìn)行嚴(yán)格定義如下：保健食品指聲稱具有特定保健功能或者以補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)為目的的食品。即適宜于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能，不以治療疾病為目的，并且對人體不產(chǎn)生任何急性、亞急性或者慢性危害的食品。依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局規(guī)定，列入既是食品又是藥品的物品名單的中藥材共84種[81]，可用于保健食品的共114種[82]，保健食品禁用物品共59種[83]。為保證保健食品質(zhì)量安全可靠，確保其不含有禁用物品列表中的物種，有必要對其原材料物種來源進(jìn)行監(jiān)控。

目前食品監(jiān)控多采用蛋白質(zhì)或DNA序列分析方法，基于蛋白質(zhì)的分析方法主要包括免疫組化分析、高效液相色譜(HPLC)和薄層色譜(TLC)等[84，85]。然而上述方法僅適用于新鮮食品，對于已經(jīng)過深加工的食品，其效率較低；相較而言，基于DNA序列的鑒定方法更為適用，DNA序列提供的有效信息比蛋白質(zhì)豐富，且易于提取，即使供試樣品量較少也能夠獲得滿足后續(xù)分析的基因組DNA，適用于不同類型食物，因此可選用基于DNA序列的方法對深加工食品進(jìn)行鑒定[86-88]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記已逐漸用于追蹤食品生產(chǎn)工業(yè)流水線上的原材料[88-90]。研究者正在嘗試將DNA條形碼分子鑒定技術(shù)應(yīng)用于保健食品原材料及深加工制品物種鑒定方面，實(shí)現(xiàn)其在保健食品原料質(zhì)量控制方面的作用，以保證食品質(zhì)量安全并有效防止商業(yè)欺詐現(xiàn)象。De Mattia等[91]采用CBOL提出的核心條形碼序列matK+rbcL及trnH-psbA間隔序列對唇形科(Lamiaceae)薄荷屬(Mentha)、羅勒屬(Ocimum)、牛至屬(Origanum)、鼠尾草屬(Salvia)、百里香屬(Thymus)和迷迭香屬(Rosmarinus)植物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示除牛至屬墨角蘭(OriganummajoranaL)和牛至(OvulgareL)兩個(gè)物種由于雜交事件使得種內(nèi)變異均高于其種間變異之外，大部分樣本都能夠鑒定到物種；matK和trnH-psbA序列能夠有效區(qū)分市售正品羅勒(OcimumbasilicumL)及其同屬植物。Xin等[29]對“藥食同源”的枸杞子進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明ITS2序列能夠區(qū)分寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)、枸杞(Lchinense)和黑果枸杞(Lruthenicum)三個(gè)物種，可以作為枸杞子及其近緣物種鑒定的DNA條形碼。

2.3 DNA條形碼分子鑒定的其他應(yīng)用

中藥材生態(tài)型多樣性是道地藥材研究的重要組成部分，黃林芳等[92]對產(chǎn)自新疆及內(nèi)蒙古兩大生態(tài)適宜生產(chǎn)集中區(qū)(兩類生態(tài)型)野生肉蓯蓉(CistanchedeserticolaYC Ma)的psbA-trnH序列分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地肉蓯蓉psbA-trnH序列存在變異位點(diǎn)，序列比對后新疆、內(nèi)蒙古產(chǎn)肉蓯蓉在191 bp處存在G-A變異，該序列可以區(qū)分野生肉蓯蓉生態(tài)型。由于植物不同的栽培品種基因遺傳變異較小，且往往存在雜交繁育事件，采用通用DNA條形碼序列進(jìn)行藥用植物栽培品種水平的鑒定存在局限性。Kane和Cronk提出基于整個(gè)葉綠體基因組和大部分核基因組的“超級條形碼(ultra-barcoding)”方法[93]，與傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)僅需要相對較短的通用DNA序列相反，該方法將葉綠體全基因組與部分核基因組相結(jié)合，為證明物種水平以下的遺傳多樣性提供充足的信息，能夠區(qū)分純系和雜交品系，因此該方法比傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)靈敏度更高。Li等[94]提出利用單分子測序技術(shù)的環(huán)狀一致測序策略的葉綠體基因組測序與SNP檢測流程，該方法具有迅捷的拼接效率和對SNP的高精度檢測能力，在基于葉綠體基因組序列的進(jìn)化生物學(xué)和基因組學(xué)研究方面有著巨大的應(yīng)用前景，也是推進(jìn)藥用植物超級條形碼研究的有力工具。Kane等[95]采用超級條形碼對可可(TheobromacacaoL)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)可可葉綠體基因和核基因中存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)，有利于鑒別不同栽培品種。該研究為中藥“道地藥材”品種及鑒定提供了新思路。

除上述應(yīng)用領(lǐng)域之外，亦有研究者將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于食用菌鑒定中。李艷春等[96]對于云南食用牛肝菌的研究表明，被云南當(dāng)?shù)厝苏J(rèn)為的4“種”牛肝菌經(jīng)鑒定為12個(gè)獨(dú)立物種，該研究篩選出rpbl序列作為牛肝菌屬(Boletus)的核心條形碼，tefl-α和rpb2可作為輔助條形碼用于該屬真菌的鑒定。Avin等[97]基于ITS序列對側(cè)耳科(Pleurotaceae，平菇Pleurotusostreatus、杏鮑菇Peryngii)、膨瑚菌科(Physalacriaceae，金針菇Flammulinavelutipes)和小皮傘科(Marasmiaceae，香菇Lentinulaedodes)中的常見食用菌進(jìn)行鑒定，證實(shí)ITS序列能夠作為擔(dān)子菌分類鑒定的核心DNA條形碼。在此基礎(chǔ)之上Avin等[98]基于IGS1和ITS序列相結(jié)合對栽培平菇(來源于側(cè)耳屬Pleurotus)的遺傳變異情況和物種界定進(jìn)行分析。

3 展望及挑戰(zhàn)

隨著十余年的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)已逐漸走向成熟，該技術(shù)已由科研人員的理論及實(shí)驗(yàn)研究層面逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槊嫦蚴袌觥⒚嫦蚱髽I(yè)、面向食品藥品監(jiān)督管理部門等的實(shí)際應(yīng)用方面的研究。該技術(shù)為緩解食藥監(jiān)管、瀕危物種監(jiān)管及海關(guān)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫部門，醫(yī)藥企業(yè)，農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等不同行業(yè)缺乏傳統(tǒng)分類學(xué)人才的現(xiàn)狀奠定基礎(chǔ)。將DNA條形碼分子鑒定法應(yīng)用于中藥材鑒定，無疑是對傳統(tǒng)藥材鑒定方法的一個(gè)巨大補(bǔ)充。構(gòu)建中藥材DNA條形碼分子鑒定數(shù)據(jù)庫，有利于對中藥材的準(zhǔn)確快速鑒定，可滿足不同行業(yè)人員對中藥材鑒定的需求，對保證臨床用藥安全提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

物種鑒定能夠確保藥品的“真?zhèn)巍保行С煞只蛴行Р课缓繙y定則可確保藥品的“優(yōu)劣”，二者均是藥品質(zhì)量控制工作中不可或缺的步驟。雖然DNA條形碼技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景，但在研究過程中亦會遇到各種挑戰(zhàn)，該技術(shù)并不能完全替代其他現(xiàn)有鑒別技術(shù)手段，如顯微、理化、色譜和光譜等對中藥材、飲片及中成藥進(jìn)行物種鑒定和質(zhì)量控制。不同入藥部位的中藥材根據(jù)其組織結(jié)構(gòu)特征不同，藥材在采收時(shí)所含生活細(xì)胞的量均具有差異，某些特定部位，如根皮等其外部多具有木栓組織，其中的木栓細(xì)胞為死細(xì)胞，DNA降解程度較高，會對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生一定影響，在操作時(shí)應(yīng)當(dāng)盡量去除此類組織。此外，儲存時(shí)間較久、貯藏養(yǎng)護(hù)方式不當(dāng)造成中藥材、飲片和中成藥生蟲、變色、走油或霉變等現(xiàn)象，會嚴(yán)重影響其質(zhì)量和療效，此類情況在進(jìn)行DNA條形碼鑒定過程中，可能會由于DNA降解過于嚴(yán)重而無法成功獲得其條形碼序列，亦或由于霉變使得提取到的藥材DNA被真菌污染從而影響鑒定結(jié)果。因此，在實(shí)際藥檢工作中如若遇到上述情況，須將DNA條形碼技術(shù)與其他方法相結(jié)合進(jìn)行檢驗(yàn)，綜合評價(jià)藥品質(zhì)量。

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DNA Barcoding of Traditional Chinese Medicine

XIN Tianyi1，LEI Meiyan2，SONG Jingyuan1,2*

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation，Chongqing 408435，China)

DNA barcoding provides a new opportunity to the development of Authentication of Chinese Materia Medica.The establishment of the DNA barcoding system for herbal materials and the online DNA barcoding database are accelerating the standardization and internationalization of the authentication methods of Chinese Materia Medica.The guiding principles for molecular identification of traditional Chinese medicine using DNA barcoding technology have been documented in the enlarged edition III of Chinese Pharmacopoeia(2010 edition).These principles strongly support the identification of the traditional Chinese medicine.It will play an important role in the market circulation and supervision of traditional Chinese medicine and patent Chinese medicine，identification of genuine medicinal materials，and quality control of functional food and other food in the future.The combination of DNA barcoding and other identification techniques recorded in Chinese Pharmacopoeia can perform the comprehensive evaluation and effective supervision to the drug quality.

herbal materials；DNA barcoding；identification；ITS2；psbA-trnH；COI

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.020

2014-01-09)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373922)

*

宋經(jīng)元，Tel：(010)57833199，E-mail：jysong@implad.ac.cn