卷丹百合鱗莖高效離體再生體系的研究△

鐘燦，王蕾，劉浩，肖深根，張水寒*

(1.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湖南農業大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128)

·中藥農業·

卷丹百合鱗莖高效離體再生體系的研究△

鐘燦1，王蕾1，劉浩1，肖深根2，張水寒1*

(1.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湖南農業大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128)

目的：以湖南主栽卷丹百合的鱗莖為起始外植體，建立卷丹百合鱗莖高效離體再生體系。方法：比較消毒方法、不同6-BA濃度、培養基組合和環境條件等對鱗莖污染率、不定芽的誘導、伸長和生根的影響。結果：用8% NaClO消毒15 min配合0.1% HgCl2消毒15～20 min后，消毒效果較好，鱗片成活率高；溫度為26±2 ℃，光照強度為2000 Lx條件下，6-BA濃度為2.5～3.5 mg·L-1，鱗片萌芽最快，不定芽生長最健壯；0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D培養基組合有利于不定芽的生長；0.5 mg·L-1NAA培養基組合最有利于不定芽的生根，移栽成活率高達100%。結論：建立此體系為卷丹的脫毒苗培育和品種改良提供一定技術支持。

湖南；卷丹；鱗片；高效；離體再生

卷丹(LiliumlancifoliunThunb.)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)的多年生球根類植物，藥食兩用，藥用及食用價值較高，國內外市場需求量越來越大，也是目前湖南省中藥材種植的主栽品種之一，種植面積超過25 000 hm2[1]。

卷丹百合的繁殖以優質鱗莖無性繁殖為主，但無性繁殖存在繁殖系數小、種性退化、病害加重等問題，且需要大量優質種球，不利于卷丹種植的可持續發展和經濟效益的提高。而高效離體再生能大大提高鱗莖的繁殖系數，快速提供更多優質的種苗，且能為卷丹百合脫毒苗和新品種的培育提供了可靠的技術支持。目前國內外諸多學者對百合的組織培養的進行研究，起源較早[2-4]，然而，關于卷丹百合的高效離體再生的研究近幾年才慢慢興起[5-9]，針對卷丹忌連作、病害嚴重等問題，對其脫毒快繁技術研究鮮有報道。本課題組針對組織培養3個最主要影響因素外植體的選擇、培養基類型和環境條件[10]，利用卷丹百合的鱗莖，通過對卷丹百合消毒方法、培養基組合和培養環境條件進行研究，建立了卷丹百合鱗莖離體高效再生體系，并篩選適合進行脫毒處理的溫度，以期為卷丹百合脫毒苗的培育和品種改良提供一定試驗基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試品種

湖南龍山縣百合種植專用品種：卷丹百合，由湖南省中醫藥研究院謝昭明研究員鑒定為卷丹百合。

1.2 培養基

將接種工具、培養器皿以及不同的培養基在立式壓力蒸汽滅菌鍋121 ℃，105 Kpa條件下滅菌20 min后使用。培養條件溫度為26±1 ℃、光強2000 Lx、濕度80%、每d光照14 h。

1.2.1 初代培養基篩選：MS+0～4.5 mg·L-16-BA。

1.2.2 繼代培養基優化：以MS為基本培養基，按照L9(34)正交試驗試驗設計，分別考察6-BA、NAA、2，4-D 3個因素對卷丹百合不定芽的生長的影響，每個因素設計3個水平，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平 mg·L-1

以上培養基的均添加200 mg·L-1的肌醇，30 g·L-1蔗糖和6.0 g·L-1瓊脂，pH值均為5.5～5.8。

1.2.3 生根培養基篩選：1/4 MS(記作處理A，下同)；1/2 MS(B)；1/4 MS+0.5 mg·L-1IBA(C)；1/4 MS+1.0 mg·L-1IBA(D)；1/4 MS+0.1 mg·L-1NAA(E)；1/4 MS+0.5 mg·L-1NAA(F)。以上培養基的均添加200 mg·L-1的肌醇，20 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1瓊脂，pH值均為5.5～5.8。

1.3 實驗方法

1.3.1 卷丹百合的消毒 取干凈、無病斑的卷丹百合鱗莖，加適量洗衣粉用自來水沖洗1～2 h后，在超凈工作臺上用70%酒精浸泡1 min，然后用8%的NaClO加數滴吐溫浸泡10～20 min，用無菌蒸餾水清洗5 次，再用0.1% HgCl2加數滴吐溫浸泡0～25 min，或者用0.1% HgCl2加數滴吐溫浸泡15 min后把鱗莖切成1 cm2左右的小鱗片再用0.1% HgCl2浸泡5 min二次消毒方法，最后用無菌水洗4～6次，接種后統計鱗片的污染率和鱗片生長情況。

1.3.2 卷丹百合離體再生培養基的篩選 在超凈工作臺上將鱗莖切成1 cm左右的小鱗片作為起始外植體，接種在初代培養基上，15 d后統計芽分化率和每個鱗片上芽的數量，隨后轉接到繼代培養基上，30 d后統計芽的生長情況。當芽伸長到3～5 cm后，轉接到生根培養基上，統計根的生長率和生長情況，待長出健壯根系后，并煉苗3～7 d，移栽到高溫高壓滅菌的珍珠巖：蛭石：泥炭土為1∶1∶2的栽培基質中，10 d后統計移栽成活率。

1.3.2卷丹百合離體再生培養條件的篩選 將接種的卷丹百合鱗片培養條件溫度為26～40 ℃、光強0～4000 Lx、濕度80%、每d光照12 h條件下培養，統計其萌芽啟動時間、不定芽誘導率和鱗莖生長情況等，優選最佳培養條件。

2 結果與分析

2.1卷丹百合鱗片消毒方法的研究

表2 不同消毒組合的消毒效果

用同樣濃度的NaClO和HgCl2對卷丹百合鱗片進行不同時間的消毒處理，5 d后統計不同鱗片的污染率和成活率。由表2可以看出，單獨使用8%的NaClO消毒，隨著消毒時間的延長，鱗片的污染率有所降低，但總體來說消毒不夠徹底，最終鱗片都因為污染成活率為0。然而用NaClO配合0.1% HgCl2進行消毒，隨著HgCl2使用時間的延長污染率顯著降低，當HgCl2消毒時間增至25 min時，污染率最低為0。而用8%NaClO消毒10～15 min配合0.1%的HgCl2消毒15～20 min時，5 d左右鱗片轉綠，9 d左右開始萌發不定芽，成活率最高。當NaClO消毒時間為20 min，或者HgCl2消毒時間為25 min，以及NaClO消毒15 min 配合HgCl2消毒15 min，將鱗片切開再利用HgCl2進行5 min二次消毒時，大部分鱗片組織壞死發白，成活率明顯降低。因此建立卷丹百合鱗莖再生體系的最佳消毒方法為以8% NaClO消毒15 min配合0.1% HgCl2消毒15～20 min，其污染率較低，鱗片成活率高達90%以上。

2.2 6-BA濃度卷丹百合鱗片分化性能的影響

表3 6-BA濃度對鱗片分化性能的影響

從表3可以看出，6-BA對卷丹百合鱗片不定芽的分化有明顯的促進作用，在不添加6-BA的培養基中鱗片的萌芽啟動時間、不定芽分化率和平均芽數都明顯低于添加了6-BA培養基中的，隨著6-BA濃度的增加卷丹百合鱗片不定芽的誘導率和平均芽數呈現增長趨勢，卷丹百合鱗片芽誘導率最高和平均芽數最多均是6-BA濃度為4.5 mg·L-1時，分別為94.02%和5.36個。而鱗片萌芽啟動時間則有所不同，6-BA濃度在0～2.5 mg·L-1范圍內，鱗片的萌芽啟動時間隨著6-BA濃度的增加而提前，當6-BA濃度為2.5 mg·L-1時，鱗片的啟動時間最快為9 d，而當6-BA濃度為3.5 mg·L-1和4.5 mg·L-1時，雖然鱗片的不定芽誘導率和不定芽平均數都高于6-BA濃度為2.5 mg·L-1時，但是萌芽啟動時間推遲到10 d，且繼代培養過程中發現初代培養中6-BA濃度越高，其不定芽生長較為緩慢，不利于壯苗培育。因此，6-BA濃度對鱗片的分化性能有影響，2.5～3.5 mg·L-16-BA濃度適宜卷丹百合鱗片的分化。

2.3 不同激素配比對鱗片不定芽生長的影響

表4 不同激素組合對鱗片不定芽生長情況的影響

表5 方差分析表

*代表P<0.05。

為了研究適合卷丹鱗片不定芽生長的培養基，獲得更多健壯的再生植株，提高其再生頻率。按照L9(34)正交試驗試驗設計，分別考察6-BA、NAA、2，4-D 3個因素對卷丹百合不定芽生長的影響。由表4直觀分析結果可以看出，對不定芽株高的影響試驗因素是2，4-D的R值最大，因素6-BA次之，NAA的R值最小，說明參試因素對卷丹鱗片不定芽生長的影響順序為2，4-D>6-BA>NAA。從表5的方差分析結果中可以看出，2，4-D對不定芽伸長的影響存在顯著差異(P<0.05)，6-BA和NAA對其伸長影響未達到顯著差異水平(P>0.05)。這說明激素對不定芽生長的影響2，4-D占主導作用，方差分析結果與直觀分析結果一致。因此MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D最適合卷丹鱗片不定芽的生長，有利于培育壯苗。

2.4 環境條件對卷丹百合鱗片分化性能的影響

表6 不同光照度對鱗片分化性能和生長的影響

表7 不同溫度對鱗片分化性能和生長的影響

由表6、表7可以看出，光照強度和溫度對卷丹百合鱗片組織培養有一定影響。光照強度的大小影響鱗片萌芽啟動時間、分化頻率以及小鱗莖的顏色，當鱗片處于黑暗條件下(光照度為0 Lx)時，其萌芽啟動時間最早為8 d，而不定芽誘導率則是當光照度為2000 Lx時最高為90.12%，且生長的小鱗莖為綠色，生長較快，萌發后15 d左右有葉片長出，葉片呈鮮綠色，生長健壯。而在光照強度為0和4000 Lx條件下的小鱗莖生長緩慢，0 Lx條件鱗莖呈白色，有少量短小的葉片萌發也呈白色，4000 Lx條件下鱗莖呈深褐色，12 d未見葉片生長。溫度對鱗片的不定芽分化影響顯著，對小鱗莖的生長影響較大，主要表現為高溫條件下萌芽啟動時間明顯延長，不定芽誘導率顯著降低，鱗莖生長緩慢甚至枯死。因此卷丹百合鱗片離體再生的適合的光照度和溫度分別為2000 Lx和26 ℃。而高溫對不定芽的誘導有抑制作用，不利于其生長。因此可以利用這一特性先培育壯苗，再通過空氣熱處理組培壯苗進行脫毒的處理。

2.5 卷丹百合鱗片不定芽生根的研究

表8 不同激素組合對不定芽生根的影響

++++根系很多；+++根系多；+++根系一般；+根系少；-根系無根。

為了研究適合卷丹鱗片不定芽生根的配方，分別用不同的培養基對不定芽進行生根處理，統計生根率，記錄其生根情況，統計移栽成活率。由表8可知，不同的培養基組合對卷丹鱗片不定芽的生根有明顯影響，F組中不定芽生根率最高為90.32%，且根系條數最多，生長速度最快，移栽成活率達到100%，而D組中不定芽生根率為0。培養基添加NAA的生根率和移栽成活率高于不添加任何激素的，而培養基中添加IBA生根率和移栽成活率最低。基本培養基MS中大量元素越少其生根率越高，根系數量和生長速度越快，移栽成活率也越高；NAA濃度為0.5 mg·L-1時生根率、根系數量、根系生長速度和移栽成活率高于NAA為0.1 mg·L-1時，而IBA濃度濃度越高其生根率和移栽成活率越低。因此選擇1/4MS+0.5 mg·L-1NAA作為卷丹鱗片不定芽最適培養基組合。

A：不定芽的誘導；B：不定芽伸長圖1卷丹鱗片不定芽誘導與伸長

3 討論

本實驗采用湖南省主栽的百合品種卷丹百合的鱗莖為材料，通過對其消毒方法、不定芽誘導、不定芽的生長和生根等試驗，進行卷丹鱗莖高效離體再生體系建立的研究。結果表明：卷丹鱗莖離體再生過程中，鱗片的消毒和不定芽的生根相對較難，而不定芽的誘導和生長相對較容易。此卷丹高效離體再生體系具有消毒徹底，不定芽增殖系數高，成活率高等特點，為利用分子生物技術快速選育卷丹百合新品種和脫毒苗的培育提供了一定的技術支持。

外植體消毒徹底是保證高效再生的前提，然而在我們的試驗過程中發現，卷丹百合鱗莖消毒較為困難，需要先用70%酒精浸泡1 min后，再用8% NaClO配合0.1% HgCl2進行長時間的消毒才能有效降低污染率，可能是因為我們采用的是3年生的卷丹百合鱗莖，其本身的內生菌較多。時間較短的話細菌性污染較為嚴重，隨著培養時間的增長，其細菌布滿整個培養基，導致大部分鱗片污染，成活率降低，但是切開的鱗片用0.1% HgCl2進行二次消毒時，導致鱗片組織壞死，成活率不高，這一研究與郭海[5]關于鱗片消毒難研究一致，但是與其消毒方法和消毒時間的長短有一定差異。

本課題組通過研究發現卷丹百合鱗片的分化能力較強，在不同環境條件和不同的培養基上均能萌發出不定芽，溫度對不定芽是誘導和生長影響不大，6-BA濃度和光照強度對其不定芽是誘導和生長有一定影響，但是差異不明顯。在不定芽伸長階段，利用正交試驗考察了6-BA，NAA和2，4-D的影響，結果表明2，4-D對其不定芽的伸長起主導作用，其次是6-BA，NAA影響最小。因此卷丹百合鱗片在26±2 ℃，2000 Lx光照強度下，先用MS+2.5～3.5 mg·L-16-BA誘導其萌發不定芽，再將不定芽轉接到MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D中生長，待不定芽長得3～5 cm長時轉接到生根培養基。然而我們在試驗過程中發現單個不定芽生根較難，通過不同的培養基組合進行生根試驗發現，基本培養基中大量元素含量較低利于不定芽生根，且NAA誘導其生根的效果明顯好于IBA，這與龐新霞的研究結果一致[11]。稍帶部分鱗片轉接到大量元素含量為1/4的基本培養基中或者1/4MS+0.5 mg·L-1NAA中，生根快，根系發達，有利于培育壯苗，移栽成活率高達100%。

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Study on High-EfficientinvitroRegenerationfromBulbScalesofLiliumlancifoliumThunb.

ZHONG Can1，WANG Lei1，LIU Hao1，XIAO Shengen2，ZHANG Shuihan1*

(1.Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha，410013，China；2.College of Horticulture and Gardening，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

Objective：To establish a high-efficientinvitroregeneration system of bulb scales fromLiliumlancifoliumusing the bulb scales fromL.lancifoliumas the initial explants.Methods：The effect of sterilization，different concentrations of 6-BA，medium formulations，light intensity and temperature on pollution of bulb scales and induction，elongation and rooting of adventitious buds were compared.Results：The results showed that the optimal sterilization was using 8% NaClO for 15 min and 0.1% HgCl2for 15～20 min.The optimal adventitious buds induction formulation was MS base medium with 2.5～3.5 mg·L-16-BA，and the temperature was 26±2 ℃ with 2000 Lx light intensity.The combination of 0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D benefited the elongation of adventitious buds.And 0.5 mg·L-1NAA was the best combination of hormones for rooting，and survival rate of transplanting was 100%.Conclusion：The regeneration system provides a technical support for virus free seedling and variety improvement ofL.lancifolium.

Hunan；LiliumlancifoliumThunb.；bulb scales；high-efficient；regeneration in vitro

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.012

2014-11-14)

湖南省科技廳重點項目(2013NK2008)資助

*

張水寒，博士，研究方向：中藥資源、中藥制劑及質量標準研究。E-mail：zhangshuihan0220@126.com