回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠A沉積的影響

張玉嶺，劉 丹，陳寶貴*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠A沉積的影響

張玉嶺1，劉 丹2，陳寶貴2*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

目的 研究回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法 通過(guò)Morris水迷宮的方法檢測(cè)小鼠行為學(xué)變化，HE染色觀察各組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，免疫組化方法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP的表達(dá)。結(jié)果 中藥回神顆粒能降低APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠腦組織的A沉積（P＜0.01），提高腦組織中SorLA表達(dá)、降低Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 回神顆粒可通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)SorLA、胞膜Caveolin-1蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制Aβ生成、沉積等病理改變，防治阿爾茨海默病。

阿爾茨海默病;回神顆粒;細(xì)胞凋亡

阿爾茨海默病（alzheimer's disease，AD）以記憶、思維、行為障礙為特征，是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，占老年性癡呆的60% ～80%［1-2］。研究［3-6］提示，一種叫做β-淀粉樣蛋白的蛋白質(zhì)在腦內(nèi)的沉積會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞變性壞死最終導(dǎo)致阿爾茨海默病。回神顆粒具有補(bǔ)益五臟精氣之功，課題組前期研究結(jié)果表明，回神顆粒對(duì)AD細(xì)胞模型有較好的療效，對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用。本研究選用APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠［7］，觀察回神顆粒對(duì)其腦組織AD相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示其防治AD的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 回神顆粒由人參、石菖蒲、鹿角、靈芝、丹參、五味子、川芎等藥物組成，為武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑。

1.2 試劑與儀器 Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP 等單克隆抗體、二抗等，Western Blot相關(guān)試劑均從國(guó)外進(jìn)口，其他試劑均為分析純。Olympus顯微鏡、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)、凝膠圖象分析系統(tǒng)、多功能電泳儀、Morris水迷宮等。

1.3 動(dòng)物 雄性SPF級(jí)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠24只，6月齡，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供。同背景、同月齡的野生型小鼠8只。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠平均分為3組:模型組、空白組、中藥組，每組8只;同背景、同月齡的野生型小鼠為空白組。中藥組每天給予回神顆粒0.031 g/mL灌胃，正常組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃共4周。

2.2 取材 斷頭取腦，左側(cè)腦組織，置于4%多聚甲醛中固定;右側(cè)腦組織，置于液氮中備用，每組隨機(jī)取4只進(jìn)行HE檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［8-9］水池高度（約24 cm），水溫控制在23～25℃。在池壁上以不同形狀的標(biāo)志物標(biāo)記4個(gè)象限的入水點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別記錄東、南、西、北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，第1天實(shí)驗(yàn)前及最后1 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤去平臺(tái)，將小鼠放入水池中自由游泳60 s，以檢測(cè)各組小鼠間的游泳速度有無(wú)差異。整個(gè)測(cè)試共6 d，前5 d為隱蔽站臺(tái)實(shí)驗(yàn)，第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)。

2.4 HE檢測(cè) 常規(guī)石蠟，包埋、切片;切片常規(guī)75% ～100%梯度脫水，二甲苯媒浸，55～60°浸臘，石蠟包埋，切片（厚度4 iim），常規(guī)蘇木素-伊紅染色，脫水透明、封片;光鏡下分析結(jié)果。

2.5 免疫組化檢測(cè) 切片脫蠟入水，0.3%H2O237℃作用10 min，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）微波（95～98℃）加熱處理20 min，冷卻至室溫，PBS（pH 7.4）洗5 min，3次。加羊血清封閉，37℃ 5 min。滴加兔抗多克隆 Aβ1-42、SorLA、Caveolin-1、BACE1、PS-1、APP 抗體，37 ℃孵育2 h，PBS 洗5 min，3次，加羊抗兔IgU 37℃ 20 min，PBS洗5 min，3次。滴加DAB復(fù)合物顯色。10 min后流水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染5 min。烤干后封片。正常對(duì)照組用PBS代替一抗，其他步驟與以上程序相同。每只動(dòng)物各取1張免疫組化切片，在低倍鏡（10×10）下觀察腦片，然后在高倍鏡（40×40）下隨機(jī)選取海馬、大腦皮層5個(gè)視野，進(jìn)行圖像分析測(cè)定平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行方差齊性、正態(tài)分布檢驗(yàn)，選用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 回神顆粒對(duì)小鼠行為學(xué)的影響 見(jiàn)表1、表2。

3.2 回神顆粒對(duì)小鼠腦組織AD沉積的影響 見(jiàn)表3。

3.3 回神顆粒對(duì)小鼠腦組織中AD相關(guān)基因表達(dá)的影響 見(jiàn)表4。

4 討論

回神顆粒源自名醫(yī)張錫純，1939年張先生逝世前將其傳給弟子柳學(xué)洙，經(jīng)柳老臨床應(yīng)用40余載，療效肯定。遂將本方傳給導(dǎo)師陳寶貴教授，導(dǎo)師陳寶貴教授又進(jìn)行20年臨床驗(yàn)證后將湯劑改為顆粒劑并在藥味上加以修改。作為臨床和實(shí)驗(yàn)研究的科研用藥。在治療創(chuàng)傷性腦損傷、腦梗死、腦出血、各種癡呆等神經(jīng)疾病方面都取得良好的療效。方中人參，入脾胃二經(jīng)，大補(bǔ)元?dú)猓堂撋虬采瘛Ｊ牌讶胄摹⒎巍⑵⑷?jīng)，開(kāi)竅豁痰，芳香醒神。鹿角溫補(bǔ)肝腎，活血消腫。靈芝入脾腎，滋補(bǔ)強(qiáng)壯，安神。五味子酸溫入肺腎，斂肺滋陰、安神，其浸膏對(duì)中樞神經(jīng)有強(qiáng)壯作用，改善智力活動(dòng)，促進(jìn)基礎(chǔ)代謝。川芎、丹參行氣活血，丹參苦涼入心肝經(jīng)，消離經(jīng)之血，川芎乃血中氣藥，助清陽(yáng)而開(kāi)諸郁。現(xiàn)代藥理研究表明:人參具有抗腦細(xì)胞凋亡之功效，減輕腦水腫，可雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制過(guò)程［10］。石菖蒲、丹參、川芎具有改善腦微循環(huán)，抗自由基損傷，誘導(dǎo)自由基清除酶SOD升高以及該酶的活性恢復(fù)，減少M(fèi)DA過(guò)度生成造成的鈣內(nèi)流引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦水腫，降低顱內(nèi)壓［11］。五味子的有效成分五味子酚對(duì)氧自由基引起的大腦突觸體和線粒體損傷有明顯的保護(hù)作用［12-13］。

表1 回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中搜索平臺(tái)潛伏期能力的影響（±s，n=8）

表1 回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中搜索平臺(tái)潛伏期能力的影響（±s，n=8）

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別逃避潛伏期/s第1天 第2天 第3天 第4天 第5天模型組 63.000 0± 0.0 38.762 5±25.872 11 46.056 3±25.307 92## 30.831 2±25.961 57## 26.837 5±22.896 70##中藥組 62.181 2± 4.631 55 33.706 3±27.380 90 19.385 0±16.817 43△△ 5.837 5± 5.916 18△△ 4.960 0± 3.587 68△△正常組 43.698 8±25.269 14 39.427 5±24.554 74 19.385 0±16.817 43 5.837 5±5.916 18 4.960 0±3.587 68

表2 回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響（±s，n=8）

表2 回神顆粒對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響（±s，n=8）

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 穿越平臺(tái)次數(shù)/次模型組 0.500±0.547 7##中藥組 3.714±2.430 0△△正常組 4.143±1.864 0

表3 回神顆粒對(duì)癡呆小鼠海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=8）

表3 回神顆粒對(duì)癡呆小鼠海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=8）

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 Aβ1-42陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/個(gè)正常組 2.8±6.1中藥組 9.5±3.1△△模型組 14.6±4.5##

表4 各組小鼠腦組織AD相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s，n=8）個(gè)

表4 各組小鼠腦組織AD相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s，n=8）個(gè)

注:與正常組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 SorLA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) Caveolin-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) BACE1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) PS-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) APP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)正常組 15.2±5.3 3.7±4.6 6.8±4.5 5.6±5.4 4.8±6.1中藥組 13.5±4.2△△ 5.6±2.3△△ 8.9±3.4△△ 7.2±4.5△△ 6.5±3.1△△模型組 7.5±5.4## 11.8±3.5## 15.7±3.6## 16.8±6.2## 14.6±4.5##

本研究從A沉積在阿爾茨海默病中的作用及與AD的關(guān)系角度探討回神顆粒對(duì)阿爾茨海默病動(dòng)物模型的干預(yù)作用。為中醫(yī)藥干預(yù)阿爾茨海默病充實(shí)豐富的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床防治老年性癡呆性疾病選方用藥提供新思路。

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Huishen granule on expression of APP/PS1/tau in hippocampus in three-transgenic AD mice

ZHANG Yuling1，LIU Dan2，CHEN Baogui2*
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China 2.Tianjin Wuqing District Hospital of TCM，Tianjin 301700，China）

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of Huishenin granule on early-stage Alzheimer's disease（AD）in transgenosis AD mice.Methods Morris water maze（escape latency and crossing times）was applied to evaluate the learning and memory ability.Hematoxylin-Eosin（HE）staining was used to observe morphology changes in the brains of AD mice.Aβ1-42，SorLA，Caveolin-1，BACE1，PS-1 and APP protein in the area of hippocampus was detected by immunohistochemical method.ResultsAfter the treatment of grain-sized moxibustion，learning and memory ability in the treatment group was increased;compared with the model group，the escape latency was shorten and crossing times was increased.Compared with the normal group，the positive area and integral optical density of Caveolin-1，BACE1，PS-1，APP in hippocampus in the model group were increased（P ＜0.01）.Compared with the model group，the positive area and integral optical density of Caveolin-1，BACE1，PS-1，APP in hippocampus in the treatment group were reduced（P ＜0.05，P ＜0.01）.Conclusion The Huishen granule could significantly improve the learning and memory ability in APP/PS1/tau double-transgenic AD mice and inhibit the over expression and accumulation of Aβ，prevention and treatment of Alzheimer's disease.

Alzheimer's disease;Huishen granule;cell apoptosis

R285.5

A

2095-6258（2015）04-0683-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.04.008

全國(guó)名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目［國(guó)中醫(yī)藥人教發(fā)（2011）41］。

張玉嶺（1986-），女，博士研究生，醫(yī)師，主要從事中醫(yī)腦病研究。

陳寶貴，碩士，教授，主任醫(yī)師，電子信箱-doczhangyuling@163.com

2015-01-23）