高效液相色譜法（HPLC）檢測黃曲霉毒素B1的研究發展

盧朝婷 林巧 鞏發永 肖詩明

摘 要 由于黃曲霉毒素是一種毒性極強的劇毒物質，因此人們對它的關注越來越廣，不斷對高效液相色譜法進行改進與提高，以求得最用快速、簡潔、節約的方法求得最精確的結果。基于此，利用高效液相法，通過使用不同的前處理、凈化、衍生、檢測等手段從不同角度對食品中的黃曲霉B1毒素進行檢測，發現以甲醇-水為提取液、用多功能凈化柱凈化，通過柱后衍生在發射波長為440 nm、激發波長為360 nm時對黃曲霉毒素B1的檢出限最大。

關鍵詞 高效液相色譜；黃曲霉毒素；檢測技術

中圖分類號：TS207.3；O657.72F592.7 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）24--03

黃曲霉毒素（Aspergillus flavus toxin，AFT）是因為1960年火雞事件而被發現，黃曲霉毒素已經被分離出的有20多種，，其除了包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、等外，尚有多種黃曲霉毒素的代謝產物、異構物和相似物等。其中，以黃曲霉毒素B1（AFB1）污染的食品人體的毒性作用是非常嚴重的。并且根據人們大量的實驗發現：黃曲霉毒素的毒性是氰化鉀毒藥的10倍之多，更是砒霜的68倍[1]，除了毒性，黃曲霉毒素的致癌性是二甲基硝胺的75倍，是奶油黃的900倍。黃曲霉毒素不僅會引發肝癌，也可能引發腫瘤和各種疾病，通過鏡檢觀察霉菌的菌絲和孢子的形態特征、孢子排列、以及菌落生長特征等一系列方式，是進行產毒黃曲霉毒素的主要檢測方法。鑒定出菌株的基礎上再進行毒素的檢測。如今人們經常用來檢測的黃曲霉毒素的方法一般為以下幾種：薄層色譜法（TLC）；免疫學方法如：酶聯免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法（RIA）、免疫層析法；高效液相色譜法（HPLC）；免疫學與儀器結合法如：免疫親和柱-熒光粉光光度法、免疫親和柱-HPLC；快速測定法如：金標免疫層析法等[2]。本文主要介紹了高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1的研究進展，以及通過使用不同的萃取、凈化、衍生或改變凈化衍生等試驗順序來探討HPLC法對試驗結果的影響。

1 樣品前處理方法

樣品預處理通常是將采集好的樣品的提取和純化。通過不同的凈化柱和衍生處理方法，得到的檢出限是不同的。常用的前處理的方法有：乙腈水溶液萃取、甲醇-水溶液萃取和二次萃取。

1.1 液液萃取法（LLE）

在傳統的液液萃取法中，因為毒素在兩種不相互溶解的溶劑中的溶解度不同，因此能將毒素從一種溶劑中轉移到另一種溶劑中，通過重復幾次萃取，將絕大多數的AFT提取出來。于是，一般通過使用甲醇-水、乙腈-水等有機溶劑提取[3]。吳國華等利用60%乙腈-水溶液萃取樣品中的黃曲霉B1毒素作為試驗前處理，搖床混合30min后，通過槽紋濾紙對濾液進行過濾，然后再濾液加入0.1%的吐溫/PBS稀釋后使用玻璃纖維濾紙對濾液進行過濾，直至濾液澄清為止。然后用免疫親和柱進行凈化，得到的結果是：在線性范圍內，液相法的標準曲線相關系數R2=0.999 2，回收率為93.7%[4]。張繼斌、汪永曾等在前處理時利用甲醇+水（70+30，V/V）溶液萃取樣品中的黃曲霉B1毒素，并用高速均質器均質1～2 min，用中速定性濾紙過濾，收集濾液后用免疫親和柱凈化。使用這種前處理的方法得到的結果是：黃曲霉B1毒素的定量限為0.2 μg/kg[5]。對于脂肪含量較高的樣品可先加乙醚等溶劑。

1.2 固相萃取（SPE）

固相萃取使近幾年由以前的萃取技術相結合發展起來的。它的優點是較LIE法來說提高了AFT的回收率，能更有效的將AFT與干擾組分分離，而且操作簡單，是目前使用最廣泛的萃取方法之一[6]。Quinto等將小麥粉中的AFT經過使用甲醇-磷酸緩沖溶液提取出來，然后用柱后光化學衍生熒光進行檢測，然后凈化、濃縮。通過采用這種方法發現FAB1的定量限為0.1～0.63 μg/kg，且在這個范圍內有良好的線性關系[7]。

1.3 超臨界流體萃取（SFE）

CO2是超臨界流體萃取最常用的提取劑，但由于這種單組分液體中的溶解度和選擇性有很大的局限性，因此，為了提高提取效率，通常要加入適當的改良劑，來增強AFT在流體中的溶解度和選擇性。由liau的試驗可以看出，雖然此方法的最低檢測限較好，但是比起其它方法來說，PFE的成本高，需要專門的設備等一系列原因，因此不適合作為提取AFT的常規方法[8-9]。

1.4 二次提取

二次提取也可以提高復雜機制的檢測效率。例如，Vega分析了花生醬中黃曲霉毒素的含量。具體的操作方法：待測物先用15%氯化鈉的甲醇溶液提取，然后再用甲醇進行二次提取，結果發現B1的回收率是95.2%[10]。

2 衍生方法

當分析物不能及時直接檢測到的，通常需要將待測物質與衍生劑發生反應，產生一些如熒光特性可檢測的物質。當檢測出帶熒光的物質后，經過檢測衍生產物最后來確定待測物質。常用的衍生方法有：柱后衍生法、柱前衍生方法等。

2.1 柱后衍生法

柱后衍生方法主要包括柱后溴衍生和柱后碘衍生兩種方法。龍凌云、劉勝利等在檢測黃曲霉毒素的實驗中通過利用ECOSIL HPLC COLUMN（250 mm×4.6 mm，5μm）的色譜柱，將流動相定為：乙腈-甲醇-水（30∶60∶10）混合溶液，控制進樣量和流速分別為：10 μL和1.0 mL/min。方法采用柱后衍生檢測樣品溶液，在0.05%碘溶液濃度的作為衍生物溶液，將衍生泵流量0.3 mL/min，和激發波長熒光檢測器設置在360 nm，發射波長設定為450 nm。得到的結果檢出限和定量限分別是AFB1 0.12 μg/kg和0.40 μg/kg[11]。劉柱、陳萬琴等人，利用乙腈-水（體積比86∶14）為提取液，將樣品經提取后，經多功能凈化柱凈化。以甲醇、乙腈和水溶液作為流動相對樣品進行梯度洗脫，而后在選用C18柱分離，用C18柱分離樣品溶液后，經過在線光化學衍生，并且需要將熒光和二極管陣列測器同時進行測定。在這種操作情況下，發現黃曲霉B1毒素的檢出限為0.02 μg/kg[12]。

2.2 柱前衍生法

付成平等人發現在使用三氟乙酸的方法對中草藥提取物的黃曲霉毒素B1進行柱前衍生化實驗的測定，采用柱前三氟乙酸衍生的檢出限為0.1 μg/kg，回收率為80% ～110%[13]。雖然柱前衍生法的靈敏度高，但是由于這種方法的操作繁瑣且穩定性不高，因此現在使用這種方法的人越來越少了。

3 檢測方法

高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1的方法往往有：柱后碘衍生-高效液相色譜法、柱后溴衍生-高效液相色譜法、柱后光化學衍生化熒光反應以及柱前三氟乙酸衍生-高效液相色譜法等幾種不同的方法。因為不同的樣品使用不同的檢測方法得到的結果可能會不太一樣，所以要盡可能的避免影響試驗結果的因素。盡管按照各種不同的試驗發現黃曲霉B1毒素的熒光強度較弱，可是由于熒光檢測器具備高靈敏度、高選擇性及干擾峰少等長處。因此，熒光檢測器的反向HPLC法亦在大量的研究當中，成為近代檢測黃曲霉毒素的主要方法。但由于黃曲霉B1毒素的熒光度較弱，若直接測定熒光度會影響實驗的靈敏度和準確度，但是衍生可增強黃曲霉B1毒素的熒光強度。

3.1 柱后衍生熒光化熒光檢測

彭志兵等人對樣品經過液液萃取精華的前處理方式將黃曲霉毒分離后，采用柱后碘衍生的處理方法，并使用高效液相色譜熒光檢測器測定糧食中的黃曲霉毒素。結果發現利用該方法不僅檢測時間短，僅在24 min內完成測試，而且黃曲霉毒素線性關系的r值均高于0.999 5，回收率為80.3% ～97.0%，檢出限小于0.40 μg/kg[14]。這種方法不僅線性關系好，而且回收率較高，速度較快，更能滿足于人們對黃曲霉毒素的檢測所追求的快速和精準。

3.2 柱后光化學衍生化熒光檢測

邱文倩、傅武勝等利用柱后光化學衍生，將樣品經提取、免疫親和柱凈化后，以甲醇-水為流動相，經柱后光化學衍生并通過熒光檢測器定量，結果得出：通過采用柱后衍生的方法得到的黃曲霉毒素的回收率為94.2%～97.5%，相對標準偏差為3.6%～5.8%[15]。我們能夠看出利用這種方法的重復性好，并且有靈敏度高，能滿足食品中黃曲霉毒素基本的定性定量的檢測要求。

3.3 柱前三氟乙酸衍生化熒光檢測

在柱前三氟乙酸衍生熒光檢測是國家標準GB/T 5009.23-2006 中的第三法。這種方法的原理是使用乙腈-水溶液將試樣中的黃曲霉毒素進行提取，然后將提取液過濾后，經過裝有反相離子交換吸附劑的多功能凈化柱，目的是為了去除脂肪、蛋白質等干擾物質。通過使用三氟乙酸溶液對凈化液中的黃曲霉毒素進行衍生，并且通過附有熒光檢測器的液相色譜系統對此反應進行分析，然后用外標法進行定量[16]。但由于其操作繁瑣，穩定性弱，樣品吹干易造成損失。因此，人們漸漸開始使用檢測黃曲霉毒素的柱后衍生化方法。

試驗發現采用柱后衍生法的優點是準確、靈敏度高、簡便能夠滿足食品中黃曲霉毒素定性定量檢測要求

4 方法學分析

瑞豐等利用三氟乙酸在40 ℃條件下衍生15 min后定容，在熒光檢測器下檢測，發現樣品的回收率在72%～82.3%，檢出限為0.002 μg/kg[17]。畢瑞峰等人通過用串聯質譜的檢測方法發現，樣品經處理后用電噴霧離子化三重四級桿串聯質譜測定，發現在各自的線性范圍內，峰面積與其濃度的線性關系良好，其檢出限、定量限和平均回收率分別為0.009～0.04 μg/kg、0.03～ 0.12 μg/kg、63.0%～78.5%[18-19]。王新麗等人在試驗中通過利用高效液相色譜柱對樣液進行分離后，將樣品經過柱后衍生裝置并且與碘溶液發生反應，最后進入熒光檢測，結果發現，使用該方法對黃曲霉毒素B1的檢出限為0.03 μg/kg，定量限為0.1 ng/ mL，低、高濃度的回收率分別為：82.3%，85.7%[20]。由前人們的大量試驗及結果分析，我們可以看出，通過采用柱后衍生的方法在發射波長、激發波長分為440、360nm時對黃曲霉毒素B1的檢出限最大。

5 結語

因為黃曲霉毒素對人體的危害巨大，受到全世界的廣泛關注且人們對食品質量安全意識的逐步增加，全國政府對食品中的黃曲霉毒素特別是AFB1的含量要求越來越嚴格。不斷的推動了AFB1的檢測方法的研究進展。黃曲霉毒素的檢測方法層出不窮，其中以高效液相色譜法使用最為廣泛，受人們研究最多，產生了許多種不同的方法對樣品進行取樣、凈化、衍生等，對不同類型的食品使用不同的處理方法，以求使結果最為準確，過程最為簡潔，效率最高。

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（責任編輯：劉昀）