楚雄地區不同生境下何首烏中二苯乙烯苷HPLC測定*

魯菊芬，華燕，郭喬儀，王洪麗，張金渝

(1.云南省楚雄農業學校，云南 楚雄 675000;2.西南林業大學，云南 昆明 650224;3.云南省農業科學院藥用植物研究所，650231)

1.概述

何首烏 (Polygonum multiflorum Thunb)為蓼科 (Polygonaceae)多年生纏繞藤本植物。性味甘、澀、微溫;根據炮制方法不同分為生首烏和制首烏。生首烏:具有潤腸通便、解毒和截瘧的功效，用以治療腸燥便秘、瘧疾和瘡癰腫毒;制首烏:具有補益精血和固腎烏須的功效，用以治療肝腎不足、精髓虧虛所導致的眩暈耳鳴、重聽、失眠、健忘、驚悸怔忡及須發早白。

何首烏的化學成分主要為蒽醌類化合物、二苯乙烯甙類化合物、聚合原花青素以及卵磷脂和微量元素。經過藥理和臨床研究發現何首烏總結起來具有以下作用:抗衰老作用、對神經的保護作用、對免疫系統的影響、降血脂及抗動脈粥樣硬化作用 (血液循環)、保肝作用、對心血管系統的作用、對內分泌的影響、對腸蠕動的影響等作用。

下面將采自云南楚雄市野生何首烏和來自楚雄農校人工栽培2年何首烏做二苯乙烯苷測定。

2.材料與方法

具體方法按照《中華人民共和國藥典》(2005版)要求進行測定。

2.1 試驗儀器及色譜條件

色譜條件:乙腈:水 (22:78);檢測波長:320nm;進樣量:5ul;色譜儀:安捷倫1200系列;色譜柱:Eclipse XDB－C18(4.6*150mm，5um);柱溫:25℃。

2.2 試驗材料

對照品:2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷，購于中國藥品及生物制品檢定所，溶劑均為分析純，流動相為色譜純。

1號樣品:野生何首烏，采自云南楚雄市，經西南林業大學杜凡教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum的塊根。樣品粉碎后過60目篩網，于60℃干燥4h后置干燥器中備用。

2號樣品:2005年引自貴州凱里，生育期4個月零25天、高0.25～0.35m何首烏扦插苗在楚雄農業學校人工栽培2年，樣品粉碎后過60目篩網，于60℃干燥4h后置干燥器中備用。

2.3 試驗樣品的制備

供試品溶液:精密稱取何首烏超微粉0.1g，置于具塞錐形瓶中，加入20mL 70%乙醇，充分溶解，超聲振蕩30min，過濾，濾液置10mL容量瓶中，加70%乙醇，定容。作為供試品溶液，備用。

對照品溶液:精密稱定二苯乙烯苷標準品50mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻。作為對照品溶液，備用。(每1mL中含二苯乙烯苷標準品2mg)。

陰性樣品溶液:制備不含何首烏的陰性樣品，按供試品溶液制備的方法制備陰性溶液。即得。

2.4 試驗方法與結果

標準曲線的繪制:分別取對照樣品、供試樣品1和供試樣品2溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，考察線性關系，做出何首烏標準曲線圖。

樣品測定:按照上述方法制備各樣品的何首烏供試樣品溶液，分別測定2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷。

3.結果與分析

3.1 標準曲線的繪制

(1)最大吸收波長的測定:精密稱定對照品溶液0.0，2.0mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻。用1cm比色皿在波長200－400nm區間以空白溶液為對照進行掃描。

根據掃描曲線可知，二苯乙烯苷標準品在波長200－400nm區間有強吸收，最大吸收波長為320 nm。故本試驗選用320 nm為測定波長。

(2)色譜條件:乙腈:水 (22:78);檢測波長:260nm;進樣量:5ul;色譜儀:安捷倫1200系列;色譜柱:Eclipse XDB－C18(4.6*150mm，5um);柱溫:25℃。對照品、樣品色譜圖見圖1、圖2、圖3。

圖1 二苯乙烯苷色譜圖

圖2 何首烏樣品1色譜圖

結果表明，在現行色譜條件下，二苯乙烯苷與其他組分得到很好分離，指標成分色譜峰理論塔板數均不小于2000，指標成分色譜峰與其他峰分離度均大于1.5。陰性樣品色譜圖在待測成分保留時間處無色譜峰，對樣品測定無干擾。

(3)線性關系考察:精密稱取二苯乙烯苷對照品 (每1mL中含二苯乙烯苷標準品2mg)溶液0.0、1.0、2.5、5、8、10 mL置6個10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容。在上述色譜條件下，每份3次，每次進樣10 uL，以峰面積及其對應的質量濃度進行回歸。得回歸方程y=3533.9x–14.462，r=0.9998，線性范圍為0.2～2.0 mg/mL。

(4)精密度試驗:取二苯乙烯苷對照品溶液進樣5 uL，連續進樣5次，測定峰面積，結果峰面積RSD%為1.07%。

(5)穩定性試驗:取何首烏藥材提取液，置室內自然光下方置，于0、4、6、8、12、24 h，測定峰面積，計算。結果藥材提取液在24 h內穩定，二苯乙烯苷的RSD% 為2.14%。

圖4 何首烏的標準曲線

(6)重現性試驗:取同一批樣品5份，制備供試品溶液，進樣進行測定，結果二苯乙烯苷的RSD%為2.73。

3.2 樣品含量測定

取2個不同產地的何首烏樣品，按照前面的方法制備供試品溶液，每次進樣5 uL，按標準曲線法，測定結果見表2。

表2 何首烏中二苯乙烯苷的測定結果 (n=2)

上述通過對不同生境何首烏中二苯乙烯苷的HPLC測定結果表明，楚雄市野生何首烏和人工栽培何首烏藥材中2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷的含量差別很大，野生的為1.42%，而人工種植的為11.93%。由于所有的研究樣品均為何首烏的塊根，因此認為其含量的差別和生境有關。

4.結論

本試驗通過對不同生境下何首烏 (野生和家種)的有效成分含量測定，結果表明:產量、生長期上人工種植兩年的相當于野生8—10年何首烏;藥用價值上測定2，3，5，4—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷含量，人工栽培2年的比野生8～10年的高近8倍。因此，栽培和野生的其產量、生長期及藥用價值相差甚大，人工科學規范化栽培何首烏具有極大的意義。

本文研究樣品產地來源明確，用藥典規定方法測定，結果具有代表性。以前有一些文獻研究報道了不同產地何首烏的塊根中二苯乙烯苷的HPLC測定，但對不同生境 (栽培環境)下2，3，5，4，—四羥基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷的含量不同，屬于首次研究，它將為今后開展規范化、規模化種植和深入開發何首烏資源有指導意義。

［1］李建北，林茂.何首烏化學成分的研究 ［J］.中草藥，1993，24(3):115—118.

［2］周立新，林茂.何首烏乙酸乙酯不溶部分化學成分的研究 ［J］.藥學學報，1994，29(2):107—110.

［3］張麗艷，楊玉琴，高言明.貴州不同產地野生及栽培何首烏中二苯乙烯苷含量比較［J］.中國中藥雜志，2003，28(08):786—687.

［4］王文靜，張維明，董小玲，等.滇產何首烏藥材的化學成分研究［J］.云南中醫學院學報，2005，8(1):10—12.

［5］廖海民，胡正海.何首烏的生物學及化學成分研究進展 ［J］.中草藥，2005，36(2):311—314.

［6］廖海民，王玲麗，唐玲玲，等.不同產地何首烏中而苯乙烯的測定 ［J］.中草藥，2006，37(4):603—604.

［7］蘭茂.滇南本草 ［M］.昆明:云南科技出版社，2004，9:59—60.

［8］周秀英.何首烏抗衰老研究概述 ［J］.實用中醫藥雜志，2007，23(6):399—400.

［9］邢淑慧，賈少謙.何首烏的現代藥理研究及臨床應用 ［J］.中國醫藥導報，2006，2(26):123—124.

［10］張印發.何首烏的藥理作用研究 ［J］.中國現代醫生，2007，45(15):149—151.

［11］高瑄，胡英杰，符林春.何首烏二苯乙烯苷的調節血脂作用 ［J］.中國中藥雜志，2007，32(4):323—325.

［12］劉黎明，王艷穎.何首烏的藥理作用和臨床應用研究 ［J］.黑龍江醫藥，1999，12(2):91.