抗苗勒管激素蛋白在成年小鼠卵泡的生長發育及卵巢衰老發生發展中的調控作用

褚 靜 曾 娟 王立芹 李 騰 (西安醫學院護理學院，陜西 西安 70000)

抗苗勒管激素是由卵泡顆粒細胞分泌的一種轉化生長因子β家族的140 kU糖蛋白。多數研究認為，雌性在出生前無抗苗勒管激素表達，出生后卵泡顆粒細胞開始逐漸分泌，至青春后期和成年期到達峰值，絕經后幾乎無抗苗勒管激素表達〔1〕。研究顯示，血清抗苗勒管激素作為機體中獨立循環因子，能夠準確反映卵巢儲備和反應性，為評估女性卵巢功能的理想指標〔2〕。但其在卵泡中的表達差異性方面觀點仍未一致，同時在卵巢自然衰老過程中間質表達的改變也為見報道。本研究旨在探討成年雌性小鼠卵泡發育的不同階段及自然衰老過程中間質抗苗勒管激素表達的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 分別取12、24、36、48 w的SPF級雌性 C57小鼠各20只(南京君科生物工程有限公司)，收集12周齡小鼠不同發育階段的卵巢以及24、36、48周齡自然衰老小鼠卵巢，收集方法如下:采用陰道涂片選取發情期小鼠，腹腔麻醉后取雙側卵巢，于4%的多聚甲醛溶液中固定。

1.2 免疫組化檢測 采用免疫組織化學二步法檢測。抗苗勒管激素一抗為羊抗小鼠單克隆抗體購于南京森貝伽生物科技有限公司，檢測試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于北京寰宇科創生物科技發展有限公司。將收集的卵巢組織標本固定、脫水、石蠟包埋，常規脫蠟，3%H2O2孵育將內源性過氧化氫酶活性去除，抗原修復后抗苗勒管激素一抗4℃過夜，二抗30 min，辣根酶標記的山羊抗小鼠 IgG，室溫孵育15 min，磷酸緩沖液(PBS)洗凈后DAB顯色，無菌蒸餾水洗凈后蘇木素復染，常規脫水、透明、干燥、封片，置于光學顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗做陰性對照。結果根據細胞染色程度和所占面積進行判斷，其中細胞染色程度評分標準:0分不顯色;1分淺黃色;2分棕黃色;3分深棕色。染色細胞面積評分標準:0分染色細胞＜5%;1分:5% ～25%;2分:25% ～50%;3分:50% ～75%;4分:＞75%。取以上兩項評分的平均值為最終評分，(－)為0～0.5分;(+)為0.5～1.5分;()為1.5～2.5分;()為＞2.5分。

1.3 Western印跡檢測 取－80℃條件下保存的各周齡卵巢組織，嚴格按照試劑盒說明書操作提取蛋白，將得到的蛋白在－80℃條件下保存待用。上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%胎牛血清封閉，加入抗苗勒管激素一抗體和辣根過氧化酶標記的二抗。增強化學發光法顯色，每組重復檢測3次。采用上海迪奧生物科技有限公司的凝膠成像分析系統進行掃描，得到條帶中的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 應用SPSS15.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，進行t檢驗;計數資料采用非參數秩和檢驗。

2 結果

2.1 卵泡發育不同階段抗苗勒管激素蛋白表達情況 抗苗勒管激素蛋白表達水平隨著卵泡發育時間延長而逐漸提升，在始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇前卵泡細胞中均有表達，但在閉鎖卵泡、黃體顆粒、卵母細胞中無表達;在竇前卵泡細胞中表達水平最高，之后逐漸減弱。見圖1。

2.2 不同年齡小鼠卵巢組織中抗苗勒管激素蛋白表達情況

不同年齡小鼠卵巢組織的卵泡和間質中均存在抗苗勒管激素蛋白表達，且卵泡顆粒細胞中表達水平無明顯差異，但隨著鼠齡增加，卵巢間質細胞中抗苗勒管激素蛋白表達水平逐漸提升，見圖2。抗苗勒管激素蛋白在間質中表達水平在不同鼠齡間差異有統計學意義(P＜0.05);12周齡小鼠表達水平明顯低于其他周齡(P＜0.01);24周齡和36周齡小鼠表達水平均明顯低于48周齡小鼠(P＜0.05);24周齡和36周齡小鼠表達水平之間差異無統計學意義(P＞0.05)。其中12周齡中僅(－)20例;24周齡(－)11例，(+)8例，()1例，()0例;36周齡(－)9例，(+)9例，()、()均 1例;48周齡(－)3 例，(+)6例，()9例，()2例。

圖1 抗苗勒管激素蛋白在卵泡發育不同階段表達分布(×400)

圖2 抗苗勒管激素蛋白在不同年齡小鼠卵巢組織中表達分布(×100)

2.3 Western印跡檢測結果 12周齡小鼠卵巢組織抗苗勒管激素蛋白表達的相對灰度值為0.91±0.05，24 w時為0.72±0.09，36 w 時為0.40±0.16，48 w 時為0.07±0.02。隨著鼠齡的增加抗苗勒管激素蛋白在小鼠整個卵巢組織中的表達呈逐漸降低的趨勢(P＜0.05)。見圖3。

圖3 抗苗勒管激素蛋白在各年齡段小鼠卵巢組織中表達情況

3 討論

抗苗勒管激素與卵泡生長發育、儲備功能、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征等內分泌疾病之間存在明顯相關性〔3〕。女性機體內分泌激素中，抗苗勒管激素是隨年齡增長最先出現改變的激素，因此其水平的改變能夠較好評價年齡相關的卵巢功能下降〔4〕。研究發現，抗苗勒管激素基因缺失的雌性小鼠仍具備正常的生育能力，但生長卵泡數量在成年后明顯上升，與此同時始基卵泡數量明顯減少，大量生長卵泡閉鎖，進而出現卵子退化現象〔5〕。抗苗勒管激素基因過表達也可提升始基卵泡的丟失量〔6〕。加入抗苗勒管激素處理的卵泡后卵泡的活力、募集能力均出現明顯提升〔7〕。以上研究均顯示，抗苗勒管激素在早期卵泡發育中表現出了負性調節作用。

本研究結果與目前主流觀點抗苗勒管激素蛋白表達起始于初級卵泡中的顆粒細胞存在差異。其原因可能為目前多數研究對象均集中于未成熟動物卵巢，而在本實驗中選取成年小鼠卵巢為研究對象，說明抗苗勒管激素在成年前和成年后卵巢中的表達存在差異性，隨年齡增長，卵泡的消耗、體內氏管激素蛋白的量也逐漸降低。卵巢衰老是氧化應激、端粒長度等多種因素作用的結果。多囊卵巢綜合征患者中卵巢粒細胞中抗苗勒管激素濃度與糖基化終產物存在明顯相關性，其互相作用可能引發多患者不排卵〔8〕。本研究可推測，卵巢間質中的抗苗勒管激素在一定程度上抵抗卵巢衰老，小鼠卵泡功能及結構在衰老過程中出現變化，包括受精能力降低、通透性提升等，同時卵泡可分泌出多種細胞因子促進卵泡膜損傷進程〔9〕。因此可推測，卵巢衰老過程間質中抗苗勒管激素蛋白表達的改變源自卵泡。

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8 Durlinger AL，Kramer P，Karels B，et al.Control of primordial follicle recruitment by anti-mullerian hormone in the mouse ovary〔J〕.Endocrinology，1999;140(12):5789-96.

9 陳 曉，李銀芬，徐 鍵.抗苗勒管激素(AMH)與多囊卵巢綜合征(PCOS)卵泡發育異常的關系〔J〕.生殖與避孕，2014;34(5):383-7，400.