Aβ1～42及二氮嗪預處理對神經細胞Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達的影響

朱 瑾 夏春鳳 李艷菊 馬國詔 段瑞生 朱梅佳

(山東大學附屬省立醫院神經內科，山東 濟南 250021)

過度氧化應激與自由基毒性作用在AD的發病中起著重要作用。Aβ產生大量的自由基，可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，使酶失活，影響Na+-K+-ATP酶活性，引起神經細胞內Na+的聚集，K+的流失，細胞的離子失衡，內環境的紊亂。已有研究表明單唾液酸四已節苷脂(GM1)可以通過維持中樞神經細胞膜上的Na+-K+-ATP酶的活性〔1～4〕，起到維持細胞內外離子平衡、減輕神經細胞水腫、防止細胞內Ca2+聚集的作用;還可以對抗興奮性氨基酸的神經毒性作用，減少自由基對神經細胞的損害，起到神經保護作用。而ATP敏感鉀通道(ATP，KATP通道)開放藥物二氮嗪可降低Aβ寡聚體聚集，用二氮嗪預處理能夠抵抗Aβ1～42的神經毒性〔5〕。但二氮嗪的預處理是否影響Aβ對Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白的表達，目前尚未報道。因此，本研究旨在探討Aβ1～42及二氮嗪預干預對神經細胞Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar種系的大乳鼠(出生24 h內)，雌雄不限，由山東大學實驗動物中心提供;Aβ1～42、二氮嗪、多聚賴氨酸均購自美國Sigma公司;胎牛血清、B27 supplement及Neurobasal培養基均購自美國Gibco公司;DMEM高糖培養基購自海克隆公司;Na+-K+-ATP酶β亞基抗體購自美國Santa Cruz公司;DyLight 488，山羊抗鼠 IgG購自Abbkine公司;山羊抗鼠IgG/辣根酶標記購自中杉公司;二甲基亞砜(DMSO)購自上海生博醫學生物工程科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠皮層海馬神經細胞培養 選用Wsitar大鼠新生24 h的胎鼠，75%酒精消毒，在無菌條件下，用顯微鑷子分離出大腦皮層及海馬置于D-Hank液中，剝除腦膜，然后將腦組織剪成碎塊，0.125%胰酶(37℃)消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，吸管吹打均勻后200目不銹鋼篩網過濾，1000 r/min離心10 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，吸管吹打成單細胞懸液，加到多聚賴氨酸包被的12孔板，接種密度6×105個/ml，培養皿的接種密度 2×106個/ml，37℃、5%CO2孵育箱中培養，第二天換含2%B27 supplement的Neurobasal的培養液，以后每2 d換液1次，第7天加藥處理。

1.2.2 分組及藥物處理 Aβ1～42人工重組蛋白質0.1 mg，溶于 10 μl DMSO 中，再用 100 μl磷酸鹽緩沖液稀釋(pH7.4)，配成濃度為221 μmol/L，即為原液。將原液置于37℃恒溫箱內孵育48 h進行老化處理，4℃備用。二氮嗪(2 mg)溶于200 μl的DMSO中，終濃度為1 mmol/L，4℃備用。實驗分為四組:空白對照組、單獨 Aβ1～42干預組、二氮嗪預處理 1 h 后 Aβ1～42干預組、單純二氮嗪預處理組，每組又分為24 h及72 h兩個亞組。細胞培養第7天，二氮嗪預處理1 h后Aβ1～42干預組加入二氮嗪(50 μmol/L)預處理 1h 后加入 Aβ1～42(2 μmol/L)作用;單獨Aβ1～42干預組加入等量的磷酸鹽緩沖液預處理1 h后，加入等量Aβ1～42;單獨二氮嗪預處理組為加入二氮嗪預處理1 h后加入等量培養液;對照組加等量磷酸鹽緩沖液和培養液。分別在孵育24、72 h后進行免疫熒光及免疫印跡檢測。

1.2.3 免疫熒光檢測各組Na+-K+-ATP酶β亞基的蛋白表達培養加藥后的細胞爬片，用4%的多聚甲醛固定15 min，0.2%Triton孵育30 min，用封閉液室溫封閉60 min，去封閉液后加入稀釋的鼠抗大鼠Na+-K+-ATP酶β亞基抗體一抗(1∶50)4℃過夜，次日磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3×5 min，加二抗室溫60 min，PBST 洗3×5 min，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核后防熒光淬滅封片劑封片，用PBS代替一抗作為陰性對照，熒光顯微鏡觀察染色結果。

1.2.4 Western印跡檢測各組Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白的表達 Aβ1～42作用神經細胞24 h及72 h后提取細胞并用PBS洗滌3次后晾干，加入適量的蛋白裂能液(RIPA)裂解液苯甲基磺酰氟溶液(PMSF)(100∶1)冰浴中裂解細胞，刮勺收集細胞，4℃離心后，一組進行蛋白濃度測定，用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，另一組加1/3的loading buffer(4×)，100℃水浴10 min，－80℃凍存。次日灌膠，取相應蛋白量上樣，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗稀釋液，鼠抗大鼠Na+-K+-ATP酶β亞基抗體一抗(1∶100)于4℃孵育過夜，次日用TBST緩沖液洗3×10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體)于室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗3×10 min，加入發光劑(ECL)顯色，以β-actin作為內參，用圖像分析軟件Band Scan進行光密度積分值分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0軟件行單因素方差。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測24 h、72 h、神經細胞Na+-K+-ATP酶β亞基熒光強度 單獨Aβ1～42作用神經細胞24 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基熒光染色強度較對照組沒有明顯改變;經二氮嗪預處理后Aβ1～42作用24 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基的熒光染色強度也沒有明顯改變。單獨Aβ1～42作用神經細胞72 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基熒光染色強度較對照組顯著降低;經二氮嗪預處理后Aβ1～42作用72 h后，與單獨Aβ1～42干預組相比較有所增強;單獨二氮嗪干預組Na+-K+-ATP酶β亞基熒光染色強度與對照組和Aβ1～42+二氮嗪組沒有明顯改變。見圖1。

圖1 免疫熒光染色觀察各組細胞培養24 h、72 h后Na+-K+-ATP酶β亞基熒光強度變化(×400)

2.2 蛋白電泳檢測24 h、72 h神經細胞Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達變化 單獨Aβ1～42作用神經細胞24 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達與對照組比較沒有明顯改變;二氮嗪預處理神經細胞1 h協同Aβ1～42作用24 h后及單獨二氮嗪組Na+-K+-ATP酶β亞基的蛋白表達明顯低于對照組及單獨Aβ1～42組(P＜0.01)。單獨Aβ1～42作用72 h后，Na+-K+-ATP酶 β 亞基蛋白表達較對照組降低(P＜0.05);二氮嗪預處理1 h協同Aβ1～42共同作用72 h后，與單獨Aβ1～42干預組相比，增加了Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達量(P＜0.05);單獨二氮嗪干預組Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達明顯低于以上各組(P＜0.01)。見圖2。

圖2 免疫印跡檢測各組處理24 h、72 h Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達的變化

3 討論

老年炎性斑內的大量Aβ沉積在AD發病機制中起到重要作用。而Aβ的神經毒性機制也極其復雜，與過度氧化應激、Ca2+的超載、谷氨酸濃度的增高等有著一定的關系。

本研究提示Aβ對Na+-K+-ATP酶β亞基有影響，其機制可能與啟動細胞的氧化應激反應、神經細胞的凋亡級聯反應有關〔6〕。Aβ本身或通過多種途徑可以產生、誘導活性氧(ROS)，使神經細胞質中自由基濃度升高，它的增加使脂質過氧化，形成脂質過氧化物，蛋白被氧化修飾，線粒體功能失調〔7〕，使有氧呼吸鏈電子傳遞形成短路，減少ATP生成;還可經自由基鏈式反應的作用，使細胞膜受到損害〔8〕，繼而影響ATP酶，使其活性下降。谷胱甘肽(GSH)在抗氧化物及自由基的損傷中有重要作用，是大腦的主要抗氧化劑，氧自由基攻擊Na+-K+-ATP酶中富含的賴氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等，減少GSH的合成，加重氧化應激〔9〕;還能導致細胞內 Na+、Ca2+增加，K+降低，影響跨膜Na+濃度梯度的重建，進一步影響Na+-Ca2+交換，加重Ca2+濃度的升高。Aβ還會直接導致細胞內Ca2+的升高〔10〕，Ca2+超載也會引起細胞內環境失衡，從而導致離子通道開放，谷氨酸大量釋放到突觸間隙或直接影響谷氨酸轉運體(GLT)-1和谷氨酸-天冬氨酸轉運體(GLAST)的活性功能，從而導致突觸間隙谷氨酸濃度的異常增高及線粒體功能失調〔11〕，刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度興奮〔12〕，細胞代謝紊亂。

二氮嗪在有神經細胞毒性物質Aβ1～42長時間如72 h存在時，首先Aβ1～42啟動了細胞線粒體介導的過度氧化應激反應和細胞凋亡級聯反應，二氮嗪預開放線粒體ATP敏感鉀離子通道，它的開放對維持線粒體膜電位的極化狀態有極其重要的作用。K+主要自細胞質流向線粒體內，離子的跨膜轉運形成線粒體膜電位的升高〔13〕，細胞膜超極化或復極化，抑制電壓依賴性鈣通道的開放，減少Ca2+通過L型通道內流，以及Na+-Ca2+交換的逆轉〔14〕，有益于減少細胞線粒體內鈣超載，增強細胞在代謝應激條件下的活性。線粒體膜電位升高在一定程度上可以減少細胞內氧自由基的生成，減少了氧化應激反應，產生自身保護作用，保護了神經細胞活性，維持了細胞的ATP正常代謝，促進了細胞膜上Na+-K+-ATP酶的生理功能，增強向細胞內轉運K+的功能，從而增加了Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達水平;還使線粒體基質體積增加，能夠激活脂肪酸氧化及電子轉移，促進ATP的生成，有利于神經細胞的存活〔15〕。

但是，二氮嗪在有神經細胞毒性物質Aβ1～42較短時間如24 h存在時，一方面，有研究表明，當胞內ATP水平低到某一臨界值時，KATP通道被激活發揮作用〔16〕。另一方面，Aβ1～42作用導致細胞線粒體介導的氧化應激反應，同時還沒有啟動細胞凋亡級聯反應。因此，即使當二氮嗪預開放 KATP通道，鉀離子主要自細胞質流向組織間液，還沒有流向線粒體內。可能24 h細胞的氧化應激反應主要發生在細胞間質，而不是線粒體內。因此，Aβ1～42和二氮嗪共同作用24 h，并沒有明顯地影響到 Na+-K+-ATP酶β亞基的生理作用，可能是二氮嗪與Aβ1～42共同作用對Na+-K+-ATP酶β亞基的影響呈現時間依賴性。

另有研究證實二氮嗪作用神經細胞可導致ROS的產生，在健康細胞中此作用可能不明顯〔17〕，當單獨二氮嗪作用神經細胞時，產生氧化應激反應，影響Na+-K+-ATP酶活性。另外，二氮嗪是KATP通道開放劑，開放了KATP通道后，可促進神經細胞胞膜超極化，線粒體內膜去極化，K+主要由細胞質外流到組織間液，從而在一定程度上抑制了Na+-K+-ATP酶將2個K+泵入細胞內的生理作用。因此，24 h和72 h蛋白電泳顯示單獨應用二氮嗪明顯降低了Na+-K+-ATP酶β亞基的蛋白表達水平。

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