17β-雌二醇在大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞轉換中的作用

冷 冰 馬恩元 薛昊罡 (北華大學附屬醫院骨外科，吉林 吉林 132011)

雌激素替代療法預防和治療骨質疏松在臨床應用中已取得較好的療效，但作用機制尚未明確。目前關于雌激素對骨髓間充質干細胞(BMSCs)的成骨分化的影響尚未見報道。本研究旨在觀察17β-E2對成年大鼠來源的MSCs成骨分化的影響，探索雌激素替代治療絕經后骨質疏松的實驗機制，為臨床預防及治療骨質疏松提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大鼠BMSCs(通過實驗室分離培養及擴增，鑒定后)，高糖 DMEM(Hyclone，美國)，10%胎牛血清(Hyclone，美國)，0.25%胰酶(Promega，美國)。

1.2 主要儀器 流式細胞儀 (國產)，由吉林大學提供;Bio-Rad 550酶標儀(EMP恩普，深圳);電子顯微鏡 (日本)。

1.3 大鼠BMSCs的分離培養及擴增 應用密度梯度離心法與貼壁篩選法成功分離出MSCs。1月齡雄性大鼠(約100 g)由吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供。脊髓離斷處死，取雙側股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，經Percoll分離液(1.073 g/ml)密度梯度離心后，抽取單個核細胞層，用含10%胎牛血清的LDMEM重新懸浮細胞，以1×106/ml接種于6孔培養板中，24～48 h換液，以后每隔3 d換液，當細胞匯流近80%時傳代培養，用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化，以1∶3比例傳代培養。重復上述細胞傳代的操作即可實現MSCs的有效擴增。

1.4 流式細胞術檢測BMSCs免疫表型 應用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化收集 BMSCs，分別取 1×106個細胞與抗CD44、CD90、CD34及 CD45抗體室溫孵育30 min，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，滴加FITC標記的二抗，避光孵育30 min，0.1 mol/L PBS洗滌2次后懸浮后流式細胞儀分析。

1.5 BMSCs的生物學特性 (1)BMSCs生長曲線測定:0.25%胰酶－0.02%EDTA消化80%融合狀態的細胞，細胞計數后以每孔2×104/ml接種7塊96孔板，100 μl/孔。每天定時隨機取出一塊孔板，每孔加入10 μl CCK-8試劑和90 μl含10%FBS的LG-DMEM培養基(設5個平行孔)，同時設3個孔為空白對照(不加CCK-8)。于37℃、5%CO2孵育2 h后，在Bio-Rad 550酶標儀上，在450 nm波長，測定各孔的吸光度值(A值)，計算平均值，繪制生長曲線。(2)BMSCs細胞周期的檢測:用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化收集細胞，使其細胞數達到1×106個/樣本，PBS洗細胞2次后，加入2 ml 70%乙醇固定;固定后離心去除乙醇，PBS洗滌1次，加入RNase 0.5 ml(5 μg/ml)，37℃消化30 min，PBS 洗滌 1 次，加入 0.5 ml PI(50 μg/ml)，4℃避光染色30 min后流式細胞儀檢測。

1.6 17β-雌二醇對大鼠BMSCs向成骨細胞的影響 (1)成骨誘導液:10－8mol/L 17β-雌二醇，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μg/ml抗壞血酸，含10%FBS的 L-DMEM。(2)誘導方法:6孔板接種1×105個細胞/孔，10%FBS的L-DMEM培養24 h后換用成骨誘導液，每3 d換液，誘導3 w。(3)堿性磷酸酶(ALP)染色:利用ALP試劑盒檢測ALP表達。(4)茜素紅染色:細胞經4%多聚甲醛固定10 min后，加入2%茜素紅(pH4.2)染色10 min，充分水洗，鏡下觀察。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的分離培養及擴增 BMSCs細胞為長梭形或紡錘形，呈成纖維細胞樣，核橢圓，可見1～2個核仁。細胞匯流達80%～90%，呈魚群樣或漩渦狀排列。傳代培養的BMSCs生長旺盛，保持原代細胞的形態特征，緊密排列，更加趨向一致，見圖1。

2.2 流式細胞術檢測BMSCs免疫表型 本實驗選用CD44、CD90、CD34和CD45四種免疫學標志物，應用流式細胞術檢測第3代(P3)BMSCs表面標志表達情況。結果顯示:CD44(基質細胞表達)及CD90(干細胞表達)為陽性，而CD34(造血干細胞/祖細胞及內皮細胞陽性)及CD45(白細胞陽性)為陰性。見圖2。

圖1 BMSCs形態學特點

圖2 流式細胞儀檢測P3 BMSCs表面標志

2.3 BMSCs的生物學特性 BMSCs生長曲線:P3 BMSCs在最初接種2 d內處于生長潛伏期，在第2～4天進入對數生長期，之后細胞生長速度減慢，逐漸進入生長平臺期，平均5～6 d傳代一次(圖3A)。BMSCs細胞周期:流式細胞儀測定P3 BMSCs的DNA含量，分析細胞周期。結果顯示，大部分BMSCs細胞處于靜息期，即G0/G1期的細胞占84.29%，只有少部分細胞處于活躍的增殖期，即S+G2/M期的細胞占15.71%，說明我們獲得BMSCs具有干細胞增殖的特點(圖3B)。

圖3 P3 BMSCs生長曲線及細胞周期

圖4 P3 BMSCs成骨誘導過程中的形態學變化

圖5 P3 rMSCs經誘導向成骨分化(×100)

3 討論

絕經后骨質疏松主要是由卵巢功能衰竭、雌激素缺乏所引起，是原發性骨質疏松中最常見的一種〔1〕。據統計，我國50～60歲婦女約30%患絕經后骨質疏松，60歲以上婦女的患病率為30% ～50%〔2，3〕。BMSCs在骨髓的有核細胞群中所占含量很低〔4〕，因此要獲得足量的BMSCs，有必要進行體外大量擴增純化，用于研究和治療。

BMSCs的成骨分化受多種因素的調節〔5〕，目前較為肯定的誘導劑包括外源性化學物、細胞因子、激素、基因轉染和一些物理因素等。雌激素對BMSCs成骨分化作用的研究結果不一致，尚有爭議。有的研究證實17β-E2通過ERα/β調節，上調骨鈣素的表達對促進BMSCs成骨分化〔6〕。還有實驗發現E2通過抑制重要轉錄因子核心結合因子mRNA表達而減少成骨細胞生成，且呈劑量依賴性〔7〕。這些研究結論的不同，可能是由于細胞來源、生長發育成熟等差異所致。本研究提示了雌激素能通過增強BMSCs的成骨分化能力來發揮促骨形成作用。

自1940年Albright首次應用雌激素治療骨質疏松至今，在臨床預防和治療骨質疏松應用中取得較好療效。近年來，雌激素促進骨形成方面的研究是骨質疏松治療的熱點問題。成骨細胞、BMSCs表面均存在雌激素受體〔8〕，雌激素通過直接調節機制、旁分泌機制和細胞凋亡機制對成骨細胞和破骨細胞發揮調控作用，維持成骨與破骨效應的平衡，調節骨的代謝。本研究通過應用17β-雌二醇誘導BMSCs分化為成骨細胞，為臨床應用雌激素治療骨質疏松提供了理論根據。

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