雷公藤紅素對(duì)肝葉部分切除術(shù)后老年小鼠認(rèn)知功能和海馬Aβ表達(dá)的影響

鮑育華，萬燕杰，徐 靜，孟凡珍，葛葉盈

(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院麻醉科，上海 200135)

雷公藤其單體雷公藤紅素(celastrol)作為臨床常用的非甾體類免疫調(diào)節(jié)劑，最新研究發(fā)現(xiàn)能改善Aβ聚集及炎性反應(yīng)而改善癡呆鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［1］。Aβ及其誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激是認(rèn)知功能障礙重要的發(fā)病機(jī)制之一［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討雷公藤紅素對(duì)肝葉部分切除老年小鼠認(rèn)知功能的改善作用以及與Aβ的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物14月C57BL/6老年小鼠，♂，體質(zhì)量(32±5)g，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要藥品和試劑、儀器雷公藤紅素(上海博蘊(yùn)生物有限公司，批號(hào)2545-8659)，ELISA試劑盒(ADL美國(guó))，一步法TRIzol試劑盒(Axygen杭州)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(上海閃晶生物有限公司)，Morris水迷宮(上海吉量醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，PCR儀(Roche，德國(guó))。

1.3 給藥方法和動(dòng)物分組14月C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成:假手術(shù)組(S)、肝部分切除手術(shù)組(O)、手術(shù)+雷公藤紅素組(C)，每組32只。雷公藤紅素60 μg·kg－1，于手術(shù)前3 d上午開始腹腔注射，每日1次，直至取材當(dāng)日。假手術(shù)組和手術(shù)組注射同等容積的10%的二甲亞楓。S、O、C組部分小鼠采用Morris水迷宮檢測(cè)術(shù)后1～7 d的學(xué)習(xí)記憶能力，每組8只。各組余下的小鼠在術(shù)后12 h、24 h、3 d、7 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)，每組6只。

1.4 手術(shù)處理10%的水合氯醛(0.03 ml/10 g，ip)腹腔注射麻醉下，消毒后在劍突下腹部正中線切開1.0～1.5 cm切口，進(jìn)入腹腔游離左側(cè)葉肝臟，在遠(yuǎn)端蒂部一號(hào)絲線結(jié)扎切除肝左側(cè)葉。徹底止血后，逐層關(guān)腹。假手術(shù)組則經(jīng)皮進(jìn)腹和關(guān)腹，不切除肝葉。

1.5 行為學(xué)的檢測(cè)Morris水迷宮檢測(cè)指標(biāo)包括 ① 定位巡航實(shí)驗(yàn):在術(shù)后的d1～7記錄90 s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)的平均時(shí)間。②空間探索實(shí)驗(yàn):術(shù)后d 3、7定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，將動(dòng)物放入水中，觀察90 s內(nèi)小鼠在原安全平臺(tái)區(qū)域跨越的次數(shù)。

1.6 標(biāo)本的處理術(shù)后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)麻醉下冰上斷頭快速分離海馬放入液氮中速凍，之后－85℃冰箱保存。左側(cè)海馬用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè) Aβ、APP、γ-分泌酶的表達(dá)，右側(cè)海馬用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)測(cè)App mRNA的表達(dá)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)加樣方法參考ELISA測(cè)試盒(美國(guó)ADL公司)說明書。反應(yīng)結(jié)束后在波長(zhǎng)為450 nm的酶標(biāo)儀上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品的濃度。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)App最主要的3種異構(gòu)體為App695、App751、App770，因此針對(duì)3種異構(gòu)體設(shè)計(jì)了3條上游引物:App695上游引物:5'-GAG GTG GTC CGA GTT CCC A-3';App751上游引物:5'-GTG GCA GCG TGT TTC CCA C-3';App770上游引物:5'-AAC CTC TTC CCC AAG ATC CTG-3';共用1條下游引物和探針分別為:App下游引物:5'-TCC AGG TAC TTG ACG ACG GC-3';App probe引物:5'-TTC CCA CGA CAG CAG CCA GCA-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物:5'-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3';GAPDH下游引物:5'-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3';GAPDH probe引物:5'-CCG CCT GGA GAA ACC TGC CAA GTA TG-3'。按照熒光定量PCR試劑盒(上海閃晶生物公司)的操作說明依次加樣后在Lightcycle(Roche，德國(guó))型擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)及組間比較采用兩因素方差分析(q檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素對(duì)肝葉部分切除小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 定位巡航實(shí)驗(yàn) 與S組相比，O組術(shù)后d 2～7平均逃避潛伏期的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，其中d 3延長(zhǎng)最明顯(P＜0.01);與O組相比，C組術(shù)后d 2～6平均逃避潛伏期的時(shí)間縮短(P＜0.05)，Tab 1。

Tab 1 Each group's place navigation performance in Morris water maze(±s，n=8)

Tab 1 Each group's place navigation performance in Morris water maze(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs the same time S group;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs the same time C group

Group 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d S 27.5 ±6.8 25.0 ±7.8 24.6 ±7.9 23.5 ±6.2 25.3 ±7.6 24.3 ±7.1 25.4 ±7.9 O 30.8 ±9.7 38.8 ±6.7＊＊▲ 53.0 ±16.1＊＊▲▲ 50.7 ±14.7＊＊▲▲ 41.3 ±12.0＊＊▲▲35.9 ±9.9＊▲ 35.2 ±8.6*C 29.1 ±8.7 27.5 ±8.3 26.4 ±5.6 24.4 ±8.2 26.3 ±8.7 25.9 ±8.3 26.2 ±8.5

Tab 2 The express of APP，γ-secretase，Aβ protein in mouse hippocampus(±s，n=6)

Tab 2 The express of APP，γ-secretase，Aβ protein in mouse hippocampus(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs the same time S group;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs the same time C group

Time Group APP/μg·L －1 γ-secretase/μg·L －1 Aβ/μg·L －1 12 h S 0.30 ±0.04 0.27 ±0.03 0.39 ±0.09 24 h 0.29 ±0.05 0.27 ±0.03 0.46 ±0.05 3 d 0.29 ±0.02 0.26 ±0.04 0.42 ±0.05 7 d 0.26 ±0.04 0.25 ±0.04 0.41 ±0.02 12 h O 0.32 ±0.06 0.26 ±0.06 0.52 ±0.09 24 h 0.49 ±0.08＊▲ 0.36 ±0.05＊＊▲ 1.30 ±0.40＊＊▲▲3 d 0.75 ±0.10＊＊▲▲ 0.48 ±0.06＊＊▲▲ 2.05 ±0.23＊＊▲▲7 d 0.30 ±0.07 0.26 ±0.06 0.66 ±0.10*12 h C 0.29 ±0.03 0.27 ±0.02 0.52 ±0.11 24 h 0.27 ±0.03 0.29 ±0.04 0.54 ±0.13 3 d 0.26 ±0.03 0.28 ±0.07 0.52 ±0.10 7 d 0.25 ±0.03 0.25 ±0.02 0.51 ±0.15

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 與S組相比，O組術(shù)后d 3、7的空間探索次數(shù)減少(P＜0.05)，與O組相比，C組術(shù)后d 3的空間探索次數(shù)增加(P＜0.05)。

2.2 雷公藤紅素對(duì)肝葉部分切除小鼠海馬 Aβ、APP、γ-分泌酶、APP mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 與 S 組相比，O 組術(shù)后 T2～4時(shí)的 Aβ 表達(dá)增加，T2～3時(shí)的APP、γ-分泌酶表達(dá)增加(P＜0.05);與O組相比，C組術(shù)后 T2，3時(shí)的 Aβ 表達(dá)減少，T2，3時(shí)的 APP、γ-分泌酶表達(dá)降低(P＜0.05)。

2.2.2 與S組相比，O組術(shù)后T1～3時(shí)的APP695 mRNA升高(P＜0.05);與O組相比，C組術(shù)后T1～2時(shí)的APP695 mRNA表達(dá)減少(P＜0.05)。Tab 2。

3 討論

雷公藤在臨床上廣泛應(yīng)用于治療各種炎性反應(yīng)和免疫性疾病。近來研究發(fā)現(xiàn)，其單體雷公藤紅素與AD關(guān)系密切，通過抑制Aβ的聚集及炎性反應(yīng)，改善癡呆鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力［4］。由于Aβ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)是認(rèn)知功能障礙重要的發(fā)病機(jī)制之一［5］，因此，從理論上講雷公藤紅素有可能成為防治POCD的潛在性藥物。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中采用了雷公藤紅素 10、20、60、120 μg·kg－1組，結(jié)果表明 60 μg·kg－1組小鼠手術(shù)創(chuàng)傷后Aβ的表達(dá)最少，行為學(xué)成績(jī)最好。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素60 μg·kg－1能明顯減少肝葉部分切除小鼠海馬中Aβ42和上游物質(zhì)APP、γ-分泌酶、APP695 mRNA的表達(dá)，Morris水迷宮的檢測(cè)定位巡航和空間探索能力明顯改善。說明雷公藤紅素能夠抑制肝葉部分切除小鼠海馬內(nèi)Aβ的生成從而改善POCD的發(fā)生。

目前的研究認(rèn)為雷公藤紅素主要是通過抑制NF-κB途徑抑制Aβ聚集、炎性因子和NO的釋放以及誘導(dǎo)HSP70表達(dá)對(duì)抗Aβ的神經(jīng)損害作用［6］。我們的研究結(jié)果:雷公藤紅素在60 μg·kg－1時(shí)具有神經(jīng)元保護(hù)作用，能夠通過減少腦內(nèi)Aβ的表達(dá)來改善肝葉部分切除小鼠的認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，雷公藤紅素能夠改善肝葉部分切除小鼠術(shù)后認(rèn)知功能，可能與抑制海馬中Aβ的表達(dá)有關(guān)，由于雷公藤作用廣泛以及其內(nèi)在的毒性［7］，因此其在POCD中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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