針對小膠質細胞上BDNF表達的siRNA篩選及其抑制效應檢測

王麗娜，王秀云，左劍玲，許期年，朱衛東，賈曉明，楊建平

腦源性神經生長因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在中樞神經系統發育過程中起重要作用，同時也能維持成熟的中樞及周圍神經系統神經元的正常功能。近年來研究發現［1］，BDNF在脊髓水平傷害感受的調制中發揮了重要作用。最近研究更是將疼痛、神經元、BDNF和小膠質細胞四者緊密的連接在了一起［2～4］。作為溝通神經元－小膠質細胞的重要信息分子，我們已發現脊髓小膠質細胞釋放的BDNF在大鼠骨癌痛痛覺過敏中也起著至關重要的作用(數據待發表)。為了進一步研究BDNF在骨癌痛痛覺過敏形成中的作用，本文設計了針對大鼠小膠質細胞BDNF的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，擬采用經典的 LipofectamineTM2000為轉染劑，旨在尋找體外可有效抑制小膠質細胞源性BDNF表達的低毒，高效的干擾基因系列，為進一步的體內實驗打下基礎。此外，鑒于BDNF與小膠質細胞的功能密切相關，本文還觀察了應用經篩選驗證的高效低毒的BDNFsiRNA后，對小膠質細胞活性的標記物OX-42表達的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 大鼠小膠質細胞株:HAPI細胞株，來源于美國賓西法尼亞州醫學院神經解剖學實驗室，由南通醫學院施建華博士惠贈。

1.1.2 試劑 LipofectamineTM2000(批號:11668－019，Invitrogen公司，美國)。兔抗大鼠 BDNF一抗(批號:ab72439，Abcam公司，美國)、小鼠抗大鼠βactin一抗、HRP標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司，美國)。小鼠抗大鼠 OX-42/CD11b多克隆抗體(Chemicon/Millipore公司，美國)。Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 、Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG(H+L)和Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(Molecular Probes公司，美國);通用型熒光標記的陰性對照FAM-siRNA由上海吉瑪制藥有限公司合成。Hoechst 33258(批號:861405，Sigma公司，美國)。定量PCR試劑盒(羅氏公司，美國);PCR引物及內參由上海生物工程有限公司合成(HPLC純化)。

1.1.3 基因序列 根據 E1bashir的設計原則［5］，查找SD大鼠BDNF基因序列(GenBank accession#NM_012513)并設計3個siRNA序列(根據靶序列起始位置命名為3對siRNA1588，siRNA283，siRNA232)及1條帶合成綠色熒光標記(FAM)的通用陰性對照FAM-siRNA，由上海吉瑪制藥有限公司合成，序列經BLAST查詢，排除與其他基因同源。所有siRNA均只有21對堿基，滿足G/C含量＜50，且在正、反義3'端分別有2個不配對的TT游離堿基。序列如下:

Tab 1 siRNA oligo

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 永生化大鼠小膠質細胞復蘇后，用高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1鏈霉素)在細胞培養瓶中培養，置于CO2培養箱37℃、5%CO2、95%濕度條件下，每1～2 d換液。轉染時取對數生長期的細胞(經實驗摸索，約在傳代2～3次后達到)接種于6孔板(用于檢測表達及熒光顯微鏡拍照計算轉染效率)或96孔板(用于細胞毒性實驗)，加入不含抗生素的適量DMEM培養液(含10%的胎牛血清)繼續培養24 h。

1.2.2 轉染條件的優化

1.2.2.1 轉染細胞密度的優化 取對數生長期的細胞計數后分別接種于6孔板或96孔板穩定培養24 h后進行“偽”轉染，即只加入相同容量的細胞毒性較大的LipofectamineTM2000，分別于轉染前即刻及轉染24 h后光鏡拍照，以估算最合適的細胞接種密度。其中24孔板的接種梯度為:0.5×106、1×106、2×106;96 孔板的接種梯度為:3 ×103、1 ×104。每孔梯度組分別重復4～6復孔。

1.2.2.2 轉染比例的優化 綜合考慮LipofectamineTM2000轉染劑要求及我們以往的轉染經驗［6］，分別選擇脂質體8 μl與相應劑量的siRNA混勻形成轉染復合物，使其終濃度分別為40 μmol·L－1(1∶4)、50 μmol·L－1(1 ∶3)、80 μmol·L－1(1 ∶2);分別按照轉染劑說明書及預實驗摸索的時間，6孔細胞板于轉染時換液，每孔先加入1 ml培養液，將轉染復合物0.1 ml單獨混合孵育30 min(混合時間已經預實驗摸索)后，加入6孔板與培養基輕柔混勻，補充培養液至終容積為2 ml/孔，然后放入CO2孵箱中孵育。每孔梯度組分別重復4～6復孔。

1.2.2.3 轉染效率的測定 6孔板的細胞轉染24 h后，在培養液中加入Hoechst 33258(終濃度5 mg·L－1)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，4℃遮光預冷的丙酮固定10 min，PBS洗3遍，以特制的圓形蓋玻片加抗熒光淬滅封片劑(碧云天公司，江蘇海門)封片。速將細胞置于熒光顯微鏡下(OLYMPLUS BX60)觀察轉染效率，選擇在激發波長為488 nm下觀察FAM的綠色表達，在594 nm下觀察Hoechest 33258的藍色表達，以100倍的視野為標準，兩人同時獨立估計相同視野下綠色熒光細胞數與藍色熒光的總細胞數百分比，求FAM表達率:FAM表達率(轉染效率)=發綠色熒光細胞數/發藍色熒光的細胞總數。共計5個視野取其平均值作為轉染效率。

1.2.2.4 細胞毒性實驗 轉染24h后，采用改良的磺基羅丹明 B 法(sulforhodamine B，SRB)［7］進行各轉染條件下轉染復合物細胞毒性的測定。于酶聯免疫檢測儀(LP400型號，BioRAD公司，美國)上選擇最適波長490nm讀數測定光吸收值，并重復3次取平均值。每孔測量組分別重復6～8復孔。計算公式如下:細胞存活率/%=實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%。

1.2.2.5 BDNFsiRNA 轉染細胞 選用 siRNA與LipofectamineTM2000最佳轉染比例，混勻形成轉染復合物，轉染方法同上。所有的轉染實驗均至少重復3次。

1.2.3 Real-Time PCR測定 采用TRIzol一步法總RNA提取試劑盒提取細胞RNA。每份標本取等量RNA逆轉錄酶，按試劑盒說明操作合成cDNA及PCR擴增。BDNF引物序列(134 bp):sense 5'-CTGACACTTTTGAGCACGTGATC-3'，antisense 5'-AGGCTCCAAAGGCACTTGACT-3';18 s內參引物(134 bp):sense 5'-AACGAGACTCTCGGCATGCTAA-3'，antisense 5'-CCGGACATCTAAGGGCATCA-3'。采用染料法(SYBR Green I)進行Real-Time PCR(MJ Research OpticonTM2熒光定量PCR儀，美國)，使其最終反應體系為25 μl。反應條件為:95℃預變性10 min后，95℃變性 15 s→58℃退火20 s→72℃延伸45 s，80℃讀板1 s，共45個循環后繪制熔解曲線，72℃再延伸5 min。經多次預實驗結合熔解曲線摸索最佳反應條件，采集各自的熒光閾值循環數(Ct值)，并至少設4～6復孔進行重復，取其平均值，采用2－△△Ct方法計算基因表達的變化。

1.2.4 Western blot測定 常規ABC法抽提蛋白，變性后經10聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至聚乙烯二氟膜上，濾膜封閉2 h，分別加入一抗(BDNF:1∶100;β-actin:1∶5 000)4℃過夜;洗膜3次;二抗(山羊抗兔:1∶2 000;山羊抗小鼠:1∶10 000)室溫1 h;加發光劑ECL，曝光壓片、拍照、BIO-ID圖像分析軟件分析，計算條帶的積分光密度值(ID)，ID值為平均光密度值(D)×面積。用積分光密度值相對比較蛋白的表達。

1.2.5 熒光免疫組織化學測定 各藥物處理組(溶媒組，陰性對照組，BDNF siRNA1588組)細胞經固定后，取出6孔板內的細胞爬片，按照熒光免疫組化流程分別經血清室溫孵育后，滴加兔抗大鼠BDNF(1∶50)或小鼠抗大鼠OX-42一抗(1∶200)(如為雙標則混合滴加，效價加倍)，濕盒4℃下過夜，再滴加二抗(Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG或Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG，雙標時混合滴加，效價加倍;OX-42單標使用 Alexa Fluor 488 goat antimouse IgG)，室溫孵育3 h。切片漂洗數次后用激光共聚焦熒光顯微鏡(TLS SP2 CLSM型號，Leica，德國)觀察。每個藥物組隨機選取6張爬片進行數碼拍照，由不知情的實驗員應用計算機輔助圖像分析系統(Image Pro-plus 6.0，USA)分別對相同測量面積內的染色進行灰度分析，計算免疫陽性反應的平均光密度值(IOD/area)，計算方法為積分光密度(integrated optical density，IOD)除以測量面積(area)，每次實驗均設立空白和吸附對照。

2 結果

2.1 轉染條件的優化結果 轉染前即刻及轉染后24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照發現:6孔板中接種梯度為1×106的細胞生長狀態最好，轉染前細胞融合度高(數據未顯示)，且轉染24 h后細胞貼壁生長仍疏密合適。96孔板的接種梯度為1×104的細胞密度最合適。此外，本研究在預實驗中進行了部分轉染條件的優化，發現經2～3次細胞傳代，30 min脂質體-siRNA復合物形成時間，轉染效率最高。

此外，從Tab 2中可見轉染劑相同劑量8 μl下，與 40 μmol·L－1(1 ∶4)、80 μmol·L－1(1 ∶2)組相比，50 μmol·L－1(1 ∶3)siRNA 的轉染效率最高(P＜0.01)，最高可達到(92.2±8.3)%。而SRB結果顯示:轉染劑相同劑量 8 μl下，40 μmol·L－1和 50 μmol·L－1siRNA組的細胞存活率均達到75%以上，細胞毒性較低。由此可知，應選擇LipofectamineTM2000 8 μl復合 50 μmol·L－1siRNA(脂質體與siRNA比例為1∶3)，不僅細胞毒性低而且轉染效率高，為最佳轉染條件。詳見Tab 2，Fig 1。

Tab 2 The transfection efficiency and survival rate of transfected cells under different transfection conditions(ˉ±s，n=6)

Tab 2 The transfection efficiency and survival rate of transfected cells under different transfection conditions(ˉ±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs group 50 μmol·L －1

Concentration of siRNA/μmol·L －1 40 50 80 Ratio for siRNA and LipofectamineTM2000(W/V)1∶4 1∶3 1∶2 Transfection efficiency/% 77.3 ±3.3＊＊ 92.2 ±8.3 83.2 ±9.3＊＊Survial rate of transfected cells/% 82.6 ±6.3＊＊ 75.2 ±4.3 61.3 ±9.5＊＊

2.2 Real-Time PCR測定結果 轉染后24 h，溶媒組(僅加LipofectamineTM2000)和陰性對照組的BDNF mRNA表達沒有差異(P＞0.05);BDNF siRNA 3個組的BDNF mRNA表達與陰性對照組相比均有一定程度的降低，且siRNA1588抑制小膠質細胞BDNF基因表達最為明顯(P＜0.01)。詳見Fig 2A。

2.3 Western blot測定結果 轉染后48 h，溶媒組和陰性對照組的BDNF蛋白質表達沒有差異(P＞0.05);BDNF siRNA 3個組的對小膠質細胞的BDNF蛋白表達均有不同程度的抑制，siRNA1588抑制程度最大，詳見Fig 2B。

Fig 1 The transfection efficiency after 50 μmol·L －1siRNA treatment

2.4 熒光免疫組化測定結果 熒光雙標共聚焦顯微成像表明:BNDF和小膠質細胞標志物OX-42存

在共表達，該結果說明BNDF和OX-42共存于同一細胞水平(Fig 3A)，為BNDF干擾小膠質細胞的活性提供了直接的形態學證據。

此外，溶媒組，陰性對照組以及siRNA1588組的OX-42染色 IOD/area分別為:0.38±0.01，0.32±0.03以及0.15±0.03。與溶媒組，陰性對照組(兩對照組間 IOD/area無差異，P＞0.05)相比，siRNA1588處理組的OX-42染色明顯減淡，IOD/area明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。詳見Fig 3。

Fig 2 Down-regulation of BDNF mRNA andprotein upon treatment with siRNA

3 討論

Fig 3 BDNF/OX-42 expression of cellsby immunohistochemistry staining

siRNA技術與傳統的反義寡核苷酸技術相比較，具有嚴格的序列特異性、高效性，基因抑制效果明確、治療的針對性強、副作用小等優勢。然而神經系統的細胞系，包括神經細胞和神經膠質細胞，相對于其他細胞系來講，是較難轉染的一類細胞系。本實驗室雖已有轉染小膠質細胞的經驗［4］，但針對不同基因的干擾，要想獲得體內外的穩定轉染，仍舊需要不斷摸索轉染條件和轉染劑的種類。因此，我們同時研究了細胞傳代次數、接種密度、轉染復合物的比例及形成時間等對轉染效率的影響，以優化轉染條件。結果發現:2～3次細胞傳代，1×106接種密度(6孔板)、1∶3的脂質體與siRNA比例、30 min的復合物形成時間，轉染效率最高。

此外，提高轉染效率與降低毒性是兩個密切相關的概念，一種基因轉染載體真正應用于基因治療臨床必須同時具有這兩個特性。因此本研究同時采用了SRB法分析轉染復合物的細胞毒性。與傳統的噻唑藍法(3-4，5 diemethylthiazol-2，5 dipheuyl tetrazolium bromide，MTT)測量相比，SRB法克服了MTT法成色反應的時間依賴性，同時SRB法沒有MTT試驗具有的嚴格時間窗，從而使大規模的細胞培養實驗變得更加便利［7］。我們的結果發現，LipofectamineTM2000 8μl復合50 μmol·L－1siRNA(脂質體與siRNA比例為1∶3)，不僅細胞毒性低而且轉染效率高，為最佳轉染條件。

正常情況下，脊髓部位固有的BDNF主要來源于感覺神經纖維在脊髓的逆行性釋放。在疼痛狀態下，脊髓部位的小膠質細胞是BDNF分泌的主要來源。新近研究表明［8～10］，BDNF 是一個重要的聯系神經元和膠質細胞間信息傳遞和“對話”(crosstalk)的信號分子。我們基于BDNF中和抗體鞘內給藥的前期研究表明(數據未發表)，脊髓BDNF在大鼠骨癌痛痛覺過敏中起著重要作用。為了進一步研究BDNF在骨癌痛中的作用，我們擬采用 BDNF siRNA在體給藥技術進行深入研究。因此，本實驗設計并觀察了針對BDNF的siRNA對大鼠小膠質細胞的干擾效果，結果發現:以LipofectamineTM2000為轉染試劑，化學合成的BDNFsiRNA可成功實現對大鼠小膠質細胞的高效轉染。且結合于小膠質細胞BDNF mRNA不同位點上的siRNA對靶基因表達的抑制活性不同，其中以siRNA1588的抑制效果最好，為我們進一步利用該技術研究BDNF信號轉導通路在骨癌痛中的作用提供了實驗基礎。

此外，本文通過熒光免疫組化結合共聚焦觀察發現，BDNF與小膠質細胞的標志物OX-42共存，為BDNF干擾提供了直接的解剖學證據;且與對照組相比，經BDNF siRNA1588處理的小膠質細胞活性明顯降低(OX-42的IOD值降低)。該結果說明BDNF在小膠質細胞的活性調節中具有重要作用，針對BDNF為靶點進行的體內外干預可能可以通過調節小膠質細胞的功能，從而治療痛覺過敏。

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