鋅依賴的組蛋白去乙酰化酶選擇性抑制劑研究進展

劉紅椿，杜曉光，耿美玉，

近年來，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)作為藥物靶點吸引了眾多的關注，并且已經有HDAC抑制劑Vorinostat和Depsipeptide被美國FDA批準以皮膚T淋巴細胞瘤(CTCL)為適應癥而上市應用［1］，在實體瘤治療中的應用也處于臨床試驗階段。這標志著HDAC作為新穎藥物靶標的概念驗證性研究階段的結束，也預示著HDAC抑制劑作為抗腫瘤藥物具有廣闊的開發前景。

盡管目前關于HDAC抑制劑的設計研究及作用機制研究越來越多，但是HDAC抑制劑抗腫瘤作用的明確機制尚未闡明。目前人們提出的作用機制很多，包括促凋亡、促分化、細胞周期阻滯、抑制DNA損傷修復、上調腫瘤抑制基因、下調生長因子、氧化應激等等［2－5］，但這些作用機制往往依賴于細胞類型、實驗條件及特定的化合物。這種多個作用機制現象的出現要歸因于表觀遺傳變化的廣泛性，如組蛋白的乙酰化和去乙酰化能夠影響多種基因的轉錄。更重要的是，HDACs不僅僅能夠催化組蛋白的去乙酰化，而且能夠催化其他一些重要蛋白(如Hsp90、Tubulin等)和轉錄因子(p53、STAT1等)的乙酰化。現有的HDAC抑制劑如Vorinostat及其他一些處于臨床研究的侯選化合物往往是泛抑制劑［6］，能同時抑制多個HDAC家族成員。而這些不同亞型的HDAC往往具有不同的定位，在細胞功能調控上發揮著不同的作用，并且與不同的疾病類型相關［7－8］。這種作用機制的廣泛性使得 HDAC 泛抑制劑如 Vorinostat、TSA、Belinostat、Panobinostat、LAQ824、JNJ-26481585等會破壞多個依賴于蛋白乙酰化的細胞內過程，不僅影響腫瘤的生長和轉移［9］，而且會干擾正常的生理功能，使得HDAC泛抑制劑存在潛在的毒副作用。

因此選擇性的HDAC抑制劑不僅能夠降低毒副作用，而且能為各亞型的生物學功能研究提供探針，具有深遠的意義。本文將對HDAC選擇性抑制劑進行綜述。

1 HDAC家族主要成員的定位和功能

HDAC是一個大的酶家族，其成員目前已知有18個不同的亞型，按種系分為 4 大類:Ⅰ(HDAC 1、2、3、8)、Ⅱ(HDAC 4、5、6、7、9、10)、Ⅲ(SIRT1-SIRT7)和Ⅳ(HDAC 11)［10］。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ為經典家族，是 Zn2+－依賴性的HDAC，而Ⅲ屬于Sirtuin家族，是NAD+－依賴的HDAC。目前臨床研究的絕大多數HDAC抑制劑能夠抑制HDAC的多個亞型，這些亞型往往屬于Zn2+－依賴性的HDAC家族。而針對NAD+－依賴的HDAC的抑制劑目前研究較少，在此不予涉及。

不同亞型HDAC通常具有不同的基因表達模式、細胞定位和生物學功能。目前研究發現［11］，HDAC 1、2、3主要定位在細胞核內，在多種組織細胞中表達，并在多種腫瘤細胞中過表達，且與不良預后有關。HDAC 6主要定位于細胞質，而HDAC 4、5、7和9主要穿梭于細胞核與細胞質之間，只在部分組織細胞中表達，但是有研究表明，HDAC5的表達預示著較好的預后，這提示在腫瘤治療中最好不要抑制此類HDAC亞型。研究表明，在不同類型的腫瘤中HDAC的表達亞型和表達量不同。這種腫瘤選擇性的HDAC表達是亞型選擇性HDAC抑制劑應用的病理學基礎，也提示HDAC抑制劑的選擇性不僅能增強藥效，而且能降低毒副作用。這些發現也是促使人們開發選擇性HDAC抑制劑的原因之一。見Tab 1。

2HDAC選擇性抑制劑

應用RNA干擾技術和動物基因敲除技術研究顯示，Ⅰ類和Ⅱa類中的一些HDAC亞型，可能是抗腫瘤作用相關的靶標。其中對HDAC 1、2、3的抑制會引起細胞周期阻滯，產生細胞增殖抑制作用［15］;對HDAC 4的抑制會影響DNA損傷修復的過程［16］;對HDAC 6的抑制會影響Tubulin的乙酰化，降低腫瘤細胞的轉移能力［17］等。隨著HDAC各個亞型的具體調控機制、生物學功能以及與腫瘤類型關系的深入研究，有針對地選擇某些HDAC亞型的選擇性抑制劑對個體化治療具有重要意義，也將更受人們的青睞。

2.1 HDAC1選擇性抑制劑 HDAC 1是1996年由美國哈佛大學Taunton等［18］發現的第一個哺乳動物的組蛋白去乙酰化酶，它是多種蛋白質復合物的催化亞單位，參與組蛋白和非組蛋白的去乙酰化。HDAC 1的表達在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃腸道癌等都有明顯升高，被認為是肺癌、乳腺癌的預后指標［10］。研究發現［19］，HDAC 1 能調控周期相關蛋白的轉錄，HDAC 1的抑制主要通過上調p21的表達導致細胞周期的阻滯。

MS-275是1999年由 Suzuki等［20］合成的苯甲酰胺類HDAC 1抑制劑。與泛抑制劑的作用機制不同，MS-275不是以Zn2+為結合靶標，而是以活性口袋最狹窄的部位Phe141和Phe198相對的2個苯環為靶點，阻塞了HDAC的生理底物(組蛋白N端Lys乙酰化側鏈)伸向催化中心的通道，因此其對亞型選擇性明顯好于Zn2+為結合靶點的抑制劑。MS-275通過增加腫瘤細胞中周期阻滯蛋白p21的水平，抑制細胞增殖，促進細胞分化，在動物實驗中口服抗腫瘤活性好而且毒副作用低［21］。目前該藥物正在美國進行白血病及實體瘤的臨床Ⅱ期研究。另外，臨床研究表明，MS-275與DNA甲基轉移酶抑制劑5-阿扎胞苷聯用，對第一次化療失敗的高分化的非小細胞肺癌患者有治療作用，顯示了良好的抗腫瘤作用。

2.2 HDAC1/2選擇性抑制劑 HDAC 2與HDAC 1具有高達82%的同源性，且二者的作用機制相似，單獨酶不具有HDAC活性，必須與輔因子形成復合物才能有去乙酰化酶活性。HDAC 1和HDAC 2可直接與DNA結合蛋白如YY1、SP1等結合。HDAC 2在抑制凋亡中具有重要作用［19］。

2.2.1 Depsipeptide Depsipeptide，又名 FK228、FR901228、NSC630176，是一來源于天然產物的環肽類化合物，其對HDAC 1和HDAC 2的選擇性相似。計算機模擬的結果表明，Depsipeptide的硫醇基團可以通過一個水分子與Zn2+結合［22］。Depsipeptide對多種血液腫瘤和實體瘤都具有明顯的殺傷作用。目前Depsipeptide已經獲得FDA批準用于皮膚T細胞淋巴瘤的治療，其針對慢性淋巴細胞白血病、急性髓樣白血病和其他實體瘤的研究正處于臨床階段［23］。

Tab 1 Properties of zinc dependant HDACs

2.2.2 MGCD103 MGCD0103是一種新型的苯氨基苯甲酰胺類HDAC抑制劑［24］。MGCD0103可以抑制多種腫瘤細胞的生長，比泛抑制劑SAHA和HDAC 1特異性抑制劑MS-275的增殖抑制活性更強［24］。而另有研究表明［25］，MGCD0103主要抑制HDAC 1的活性，同時對HDAC 2、3、11都有一定的抑制作用，故其選擇性還有待進一步的驗證。MGCD0103口服有效，且顯示了良好的藥效和藥代動力學特性，目前正處于多項Ⅱ期臨床研究，是治療血液學疾病和淋巴組織增生疾病的一個比較有前景的化合物［26］。

2.3 HDAC 8選擇性抑制劑 Buggy等［27］在2000年發現了HDAC的第8個成員——HDAC 8，其在心臟、肺、腎臟和胰腺中均有表達，在肝中的表達量最高。HDAC 8與HDAC 3的同源性最高，達到34%。Knockdown實驗表明HDAC 8對細胞增殖是必須的［28］。HDAC 8在神經細胞瘤中有異常表達，選擇性地抑制其活性，可誘導神經細胞瘤的分化［13］，提示應用選擇性HDAC 8抑制劑可治療神經細胞瘤。

PCI-34051是一個低分子量的異羥肟酸類化合物，能特異性抑制HDAC 8的活性。通過激活PLCγ，PCI-34051能夠誘導T淋巴瘤細胞和白血病細胞發生caspase依賴性的凋亡，但是對其他造血細胞和實體瘤細胞無明顯影響［29］，提示PCI-34051可能發展成為一個高效低毒選擇性強的T細胞惡性腫瘤的治療藥物。

2.4 HDAC6選擇性抑制劑 HDAC6屬于ClassⅡb，其獨特之處是擁有兩個催化區域:一個起始于第215位氨基酸，另一個起始于第610位，兩個催化區高度同源，而且均含有一個與泛素結合的鋅指結構區。正常生理條件下，HDAC 6在心、肝、腎、胰等臟器中高表達［30］，而在食道癌［31］和口腔鱗狀上皮細胞癌中過表達。選擇性抑制HDAC 6對細胞的存活影響不大，但是可以明顯增加tubulin和HSP90的乙酰化水平［32－33］，從而降低細胞的運動能力和加速HSP90客戶蛋白的降解。代謝活躍的細胞尤其是腫瘤細胞中產生了大量錯誤折疊蛋白，HDAC 6能促進錯誤折疊蛋白降解，故HDAC 6的選擇性抑制可以嚴重地破壞細胞處理錯誤折疊蛋白的能力，導致細胞內的蛋白“垃圾”迅速積累，進而誘發腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞沒有明顯影響，因此近期HDAC 6的選擇性抑制劑備受關注。

2.4.1 Tubacin Tubacin是 Schreiber領導的研究組通過對7392種小分子的篩選得到的HDAC 6的抑制劑，其抑制了哺乳動物細胞的tubulin去乙酰化，但是對組蛋白的乙酰化水平、基因轉錄和細胞周期進程沒有影響，tubacin能增加tubulin的乙酰化，雖然不影響tubulin的穩定性，但是能夠降低細胞的運動性［17］。另外tubacin并不抑制Hsp90的去乙酰化，提示tubacin可能特異性抑制HDAC6-SIRT2復合物的形成，而該復合物負責tubulin的去乙酰化［34］。

2.4.2 5-Aryl-2-(trifluoroacetyl)thiophene 該化合物是由Ontoria等［35］研究的HDAC抑制劑，對HDAC 4和HDAC 6的選擇性較好，其抑制HDAC 4和HDAC 6的IC50值分別為310 nmol·L－1和 70 nmol·L－1，對 HDAC 1 的 IC50比 HDAC 6 強40多倍，而且對實體瘤細胞抑制效果較好。

2.4.3 含吡啶丙氨酸的羥肟酸類化合物 Schafer等［36］研究發現在羥肟酸上進行吡啶丙氨酸修飾，可以得到選擇性的HDAC 6抑制劑5a，其對HDAC 1的IC50是HDAC 6的25倍左右，在細胞水平能夠升高tubulin的乙酰化水平，其對腫瘤細胞的細胞毒活性較HDAC泛抑制劑弱，與蛋白酶體抑制劑硼替佐米有協同致死作用，提示聯合用藥可作為其應用的一種策略。

上述的亞型選擇性HDAC抑制劑，從嚴格意義上講，并不具有絕對的選擇性。一方面是由于HDAC各亞型在很大程度上的同源性，既照顧到抑制活性又兼顧選擇性難度較大;另一方面現有的抑制劑在分子水平的酶活評價時，僅有少數能在11個HDAC亞型上進行全面評價，大多數化合物僅選用若干HDAC酶進行篩選，所得數據不能完全確定其亞型選擇性，因此全面篩選是亞型選擇性抑制劑開發和評測的重要指標。

3 展望

Tab 2 Inhibitors activity toward HDAC enzymes

目前各種HDAC亞型的特異生物學功能、選擇性表達的腫瘤類型等都沒有完全闡釋清楚，但是結合已有的研究成果可以預測亞型選擇性的HDAC抑制劑擁有明顯的優勢，如對腫瘤組織選擇性高、毒副作用較低、可與靶向藥物的聯合應用［37］等，因此亞型選擇性的HDAC抑制劑是各大研究機構和藥廠開發的目標。盡管目前有很多HDAC的抑制劑處于不同的研發階段，但是受限于HADC亞型的同源性較高，且大多數亞型沒有晶體結構，選擇性的HADC抑制劑數量還是相當有限的，而且亞型絕對選擇性的抑制劑更是罕見。隨著HDAC亞型生物學研究的深入、晶體結構的健全和完善以及計算機模擬的合理化設計，更多的亞型選擇性的HDAC抑制劑將會涌現出來。

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