不同貯藏條件下棉花葉片DNA提取效果分析

鄭子漂　曲延英　王麗麗等

摘要：針對棉葉貯藏方法不恰當導致DNA提取得率及純度較差的問題，本研究以新鮮棉葉為對照，比較了5種貯藏條件下的棉葉DNA提取效果，以期篩選出一種棉葉貯藏的較優模式，從而提高DNA的提取得率及純度。結果表明，-20℃冷凍3 d的棉葉DNA得率最高且純度較好，甚至比新鮮葉片的DNA得率高51.4%； 3 d冷凍貯藏的DNA得率明顯高于3 d冷鮮貯藏的；7 d液氮冷凍貯藏的DNA得率明顯優于7 d硅膠干燥貯藏的和冷凍貯藏的；7 d液氮速凍貯藏的DNA純度與7 d硅膠干燥貯藏的相近。綜上所述，短期貯藏可采用-20℃冷凍保存的方法；較長時間的保存建議采用液氮速凍的貯藏方式。

關鍵詞：貯藏條件；棉葉；DNA提取；純度；得率

中圖分類號：S562+S188 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）08-0011-03

Abstract This study was conducted based on the problems that inappropriate storage could lead to poor extraction rate and purity of DNA from cotton leaves. With the fresh leaves as control， the DNA extraction effects of cotton leaves were compared after storage in five kinds of conditions to screen out a best storage method. The results showed that the DNA extraction rate of cotton leaves was the highest after -20℃ frozen storage for 3 days with better purity， which increased by 51.4% compared to that of the control. The DNA yield of 3-day frozen storage was obviously higher than that of 3-day 4℃ storage， and the 7-day liquid nitrogen frozen had clear advantages over the silica gel dry storage and 7-day frozen storage. The DNA purity of 7-day liquid nitrogen frozen was close to that of 7-day silica gel dry storage. In conclusion， -20℃ frozen storage could be used for short-term storage， while the liquid nitrogen frozen could be used for longer-time storage.

Key words Storage condition； Cotton leaves； DNA extraction； Purity； Extraction rate

近年來， 分子生物技術在棉花育種上的應用，使棉花在抗性、產量及品質改良等方面均取得了較大進展。但棉花組織中富含酚類及多糖類物質，棉葉總DNA的提取較為困難，若采集的鮮葉樣品保存不當，將嚴重影響其DNA的提取純度及得率，進而影響后續分子工作的開展[1～3]。因此，通過實驗手段找出滿足不同要求的植物葉片貯藏條件，對各項實驗的開展具有重要意義。

本研究以棉花新鮮嫩葉為對照，比較了不同貯藏條件對棉葉DNA提取得率及純度的影響，以期篩選出最佳的棉葉貯藏方法，為今后開展分子生物學和生物技術試驗提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉花品種新陸早26號、新陸早36號、新陸早42號、蘇K202、遼棉18號，種植于新疆農業大學病圃。

1.2 試劑

A液：1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0），0.5 mol/L EDTA （pH 8.0），4.5 mol/L NaCl，2% SDS，2% PVP；B液：1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）， 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）， 4.5 mol/L NaCl，10% CTAB； 5 mol/L醋酸鉀溶液，氯仿+異戊醇（V∶V=24∶1），異丙醇，無水乙醇，2%β-巰基乙醇。

1.3 樣品采集與處理方法

采集花鈴期葉寬為 1～2 cm的新鮮嫩葉，置于冰盒在5 min內帶回實驗室，迅速將每個品種的葉片分成6份并標號，每份約1 200 mg，1號樣品直接用于提取棉葉DNA， 2號樣品放入普通冰箱（4℃）冷鮮保存3 d，3號、4號樣品分別放入普通冰箱（-20℃）冷凍保存3 d和7 d，5號樣品放入液氮中（-196℃）保存7 d，6號樣品用硅膠干燥保存7 d。每個處理重復3次。

1.4 棉葉DNA提取

采用改良CTAB法提取，主要參照石慶華等[4]的方法，稍加改動。

1號樣品取 400 mg洗凈，置于研缽中，加入適量液氮，迅速研磨后，小心緩慢移入 2 mL離心管中，加A液（預熱至65℃）1 000 μL、β-巰基乙醇 40 μL，放入 65℃恒溫水浴鍋水浴1 h；取出，加入1/3體積的醋酸鉀溶液（5 mol/L），冰浴 1 h后取出，4℃下12 000 r/min離心10 min， 取上清750 μL，加1/5體積的B液后放入65℃恒溫水浴鍋中均勻水浴20 min，取出，室溫冷卻；加入600 μL氯仿+異戊醇（V∶V=24∶1）輕輕搖晃混合，平衡后12 000 r/min離心5 min；取上清液600 μL，用氯仿+異戊醇再抽提1次；取上清500 μL，加2/3體積的異丙醇，置于-20℃冰箱過夜；次日取出，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%乙醇洗滌3次，自然風干后，溶于50 μL ddH2O中備用。endprint

2、3、4、6號樣品處理和提取方法同1號樣品；5號樣品先用組織粉碎機粉碎后，再用于DNA的提取，提取方法同1號樣品。

1.5 數據處理和分析

數據采用Microsoft Excel 2003處理，采用DPS軟件進行方差分析。

DNA得率（μg/gFW）=DNA濃度×DNA溶解于ddH2O的體積/棉葉鮮重

2 結果與分析

2.1 DNA產物的得率

由圖1可以看出，冷凍3 d的棉葉DNA平均得率最高，為327.21 μg/gFW；其次為新鮮棉葉的DNA得率，平均為216.23 μg/gFW；冷鮮3 d、液氮冷凍7 d、冷凍7 d和硅膠干燥7 d的棉葉DNA得率均低于對照（新鮮棉葉），平均得率分別為193.56、116.89、35.47和20.66 μg/gFW。

對不同貯藏條件下不同品種的棉葉DNA提取得率進行顯著性分析，結果（見表1）顯示新陸早42號和新陸早36號冷凍3 d的DNA得率顯著高于對照，其它三品種則與對照差異不顯著；與對照相比，各品種冷鮮3 d的DNA得率有高有低，但均未達顯著水平；液氮冷凍7 d，各品種的DNA得率均低于對照，其中新陸早36號和蘇K202與對照的差異達顯著水平；各品種冷凍7 d和硅膠干燥7 d的DNA得率均顯著低于對照。綜上所述，就提取棉葉總DNA而言，雖不同品種間變化不同，但總體來說以-20℃冷凍保存3 d的提取效果最好，而且短期（3 d）貯藏的效果明顯優于較長期（7 d）；較長期貯藏中，則以液氮保存的效果較好。

2.2 DNA產物的純度

由圖2可以看出，對照新鮮棉葉DNA的OD260/OD280平均值為2.03，冷鮮3 d和冷凍3 d的平均值均為1.96，說明冷鮮3 d和冷凍3 d兩種方法保存的棉葉DNA提取純度較好；而冷凍7 d、液氮7 d、硅膠干燥7 d的棉葉DNA OD260/OD280平均值在1.67～1.71之間，說明用這三種處理棉葉提取的DNA中有些蛋白質和酚類物質未除盡。

由表2可以看出，各品種的棉葉DNA提取純度均以鮮葉的最高；冷鮮3 d和冷凍3 d間基本無差異，且除遼棉18號與對照差異顯著外，其余品種均與對照差異不顯著；冷凍7 d、液氮7 d和硅膠干燥7 d后，不同品種的DNA提取純度變化不同，并無統一的規律可循。

3 結論與討論

本試驗結果表明，-20℃冷凍保存3 d的棉葉DNA得率最高，純度較優。李志真等[5]曾利用冷凍方法貯藏光皮樺鮮葉15 d，結果因葉片完全褐變未能提取到DNA。而本研究發現，棉花鮮葉冷凍3 d時只發生了輕微均勻褐變，DNA提取效果很好，甚至比鮮葉的DNA得率還高出51.4%；但到第7 d時，所提取的DNA得率就很低，今后的研究應在冷凍 1～7 d內設置更細化的時間梯度，尋找最適合的冷凍期限[6，7]。

硅膠干燥法是國內外研究人員貯藏植物組織時最常用的方法，一般認為它的效果最為顯著[8～10]。何天明等[11]曾利用該法保存果樹材料，成功分離出杏的S-Rnase基因并進行了特異PCR擴增。但本試驗中，硅膠干燥法保存的棉葉DNA得率和純度都較低，可能與葉片粉碎顆粒過大有關，建議今后采用該方法時應加大粉碎力度并增加粉碎次數。

綜合來看，可采用-20℃冷凍保存的方法短期貯藏多酚類植物材料，若需較長時間的保存，建議采用液氮速凍的貯藏方式。

參 考 文 獻：

[1] 藍海燕，劉桂珍，王長海. 棉葉總DNA提取的改良方法[J].棉花學報， 2000， 12（1）：53.

[2] 王榮棟，尹經章.作物栽培學[M].北京：高等教育出版社，2004.

[3] 謝中穩， 葛頌，洪德元，等.從普通野生稻硅膠干燥的小量葉片中制備DNA用于RAPD分析和總DNA庫的建立[J]. 植物學報， 2000， 41（6）： 807-812.

[4] 石慶華，張樺，王希東，等.生物化學實驗指導[M].北京：中國農業大學出版社，2006.

[5] 李志真，謝一青，黃勇，等.不同保存方法對光皮樺總DNA提取效果的影響[J].分子植物育種，2006，4（1）：131-134.

[6] 夏玉玲，張春霖，魯成.不同處理對動物線粒體DNA提取的影響[J].蠶學通訊， 2003， 23（1）： 5-10.

[7] 易慶平，羅正榮，張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J].安徽農業科學，2007，35 （25）：7789-7791.

[8] 張國防，陳存及，邢建宏.樟樹干葉DNA提取方法的研究[J].江西農業大學學報， 2006， 28（1）：111-114.

[9] Chase M W， Hills H H. Silica gel： an ideal material for field preservation of leaf samples for DNA studies[J]. Taxon， 1991， 40（2）： 215- 220.

[10]董蔚， 黃壽先， 陳榮， 等.西南樺硅膠干燥葉DNA提取方法比較[J]. 西南林學院學報， 2010，30（4）：36-38， 43.

[11]何天明，陳學森，吳燕，等.從薔薇科果樹硅膠干燥葉片中制備DNA用于RAPD分析[J].石河子大學學報：自然科學版， 2001（1）： 237-241.endprint