黑曲霉生產檸檬酸的控制論模型

韓玲玉，成寶琨，鄭小梅，孫際賓，袁景淇

（1上海交通大學自動化系，系統控制與信息處理教育部重點實驗室，上海 200240；2中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

黑曲霉生產檸檬酸的控制論模型

韓玲玉1，成寶琨1，鄭小梅2，孫際賓2，袁景淇1

（1上海交通大學自動化系，系統控制與信息處理教育部重點實驗室，上海 200240；2中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

黑曲霉發酵是工業生產檸檬酸的主要途徑，研究該過程的動力學模型對更好地理解這一工業微生物的代謝機理有重要意義。基于黑曲霉（Aspergillus niger）檸檬酸發酵過程主要代謝途徑的分析，構建了簡化的碳代謝網絡，建立了胞內物質和酶濃度的平衡模型。引入一階閉環調節器模型描述發酵初期微生物酶系的建立過程。結合生物反應器模型，給出了重要宏觀狀態變量（如細胞物質濃度、基質濃度、產物濃度）和胞內酶濃度的動態仿真結果與實驗值的對比。

黑曲霉；檸檬酸；控制論；動力學模型；胞內酶濃度；代謝仿真

引　言

黑曲霉是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，是重要的工業微生物，在工業酶制劑、有機酸、異源蛋白等發酵生產過程中應用廣泛，其中以黑曲霉生產檸檬酸工業過程為典型代表[1]。全球檸檬酸年產量超過150萬噸，99%源自黑曲霉發酵[2-3]。

文獻報道的黑曲霉檸檬酸發酵過程模型以宏觀動力學模型為主[4-7]。近年來，帶有酶系調控機制的控制論模型引起了學術界的關注，因為它提供了集成代謝組學和蛋白組學信息，以描述代謝網絡對外界環境變化響應的可能[8-12]。隨著代謝工程[13]技術的提升，黑曲霉代謝網絡的組學信息不斷得到揭示，為控制論模型的應用提供了客觀條件。

本文在現有動力學研究基礎上，通過黑曲霉檸檬酸發酵過程中主要代謝途徑分析[14]，提出黑曲霉檸檬酸發酵過程控制論模型，并擬通過實驗加以驗證，以使該模型可以比較準確地描述黑曲霉生產檸檬酸的宏觀和微觀發酵過程，調控黑曲霉發酵過程中關鍵酶的表達，有提高檸檬酸產量的應用潛力，有助于更好地理解黑曲霉的代謝過程。

1　黑曲霉代謝網絡分析

黑曲霉的代謝網絡研究近年取得了很大進展，Sun等[15]從黑曲霉基因組學的角度探討了黑曲霉的代謝特性，建立黑曲霉基因組規（genome-scale）代謝網絡；Andersen等[16]整合多種組學及文獻信息建立了包括亞細胞定位和運輸反應的全細胞代謝網絡。上述代謝網絡包含了2000余個代謝節點和大量的動力學參數，直接模型化難度較高。本文省略了部分中間代謝產物從而得到簡化的黑曲霉檸檬酸發酵過程的代謝網絡，見圖1。其中，GLU為胞內葡萄糖，PPM代表PPP途徑中間代謝物，GLM代表糖酵解途徑中間代謝物，CITcy為細胞質中的檸檬酸（區別于線粒體中的檸檬酸），rS為比底物消耗速率，rP為比產物生成速率。將TCA循環的中間代謝物質簡化為一個代謝物質，記作TCAM，將丙酮酸、PPP途徑中間代謝產物和 TCA循環中間代謝產物作為合成生物物質的前體，記作 M（細胞物質）。圖1簡化后黑曲霉代謝途徑的主要代謝反應和對應酶種類見表1。Torres[17]已將系統生物學理論應用于一個類似的代謝網絡，取得了很好的結果。

圖1　黑曲霉檸檬酸發酵簡化代謝網絡Fig.1　Abstracted metabolic network for batch fermentation of Aspergillis niger

根據圖1所示黑曲霉生長和檸檬酸合成的主要代謝途徑，胞外碳源經糖化酶作用轉化為胞內葡萄糖（GLU），經過磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸（G6P）（此代謝途徑記為p1，其余具體代謝途徑標記見圖1），一部分葡萄糖-6-磷酸進入磷酸戊糖途徑（PPP），生成核酮糖-5-磷酸（PPM），并最終形成細胞物質，其余大部分葡萄糖-6-磷酸形成糖酵解的最終產物丙酮酸（PYR）[18]。丙酮酸一方面被氧化成乙酰輔酶 A（AcCoA），進入三羧酸循環，另一方面固定二氧化碳生成草酰乙酸（OOA）。檸檬酸經 α-酮戊二酸等（TCAM）回到三羧酸循環的起點草酰乙酸，如此完成了三羧酸循環（TCA）的主體[19]。在此過程中伴隨著細胞物質的合成，通過碳基等效處理，認為生物物質主要源自乙酰輔酶A和α-酮戊二酸。同時，能量載體（腺嘌呤核苷三磷酸ATP）和電子載體（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD）不斷地生成和消耗，呼吸鏈的主要作用是使細胞生長和維持過程達到能量和電子平衡。

表1　黑曲霉代謝反應（括號中的系數表示化學計量關系系數）Table 1　Major metabolic reactions in Aspergillis niger

表2　控制變量的數學表達式Table 2　Mathematical forms of control variables

2　模型構建

2.1控制變量

在控制論模型中，有兩類控制變量，控制酶合成速率的控制變量記為 u，控制酶活性的控制變量記為 v[20-22]。根據代謝網絡每個節點的拓撲結構不同，分為發散代謝節點和收斂代謝節點[23]，發散代謝節點對應的控制變量定義為互補型競爭控制變量，用上角標c標記，收斂代謝節點對應的控制變量定義為替代型控制變量，用上角標s標記[20]。代謝途徑 Pa、Pc、Pe、Pf對應的控制變量為互補型控制變量，記為 uc、vc；代謝途徑Pb、Pd對應的控制變量為替代型控制變量，記為 us、vs。控制變量的數學描述見表2。

2.2動力學模型

根據動態物質平衡，胞內主要代謝物的濃度變化率為

式中，C、S、v的具體描述分別見式（3）～（5），黑曲霉對葡萄糖的比底物消耗速率Sr采用 Monod模型描述

但是在實際發酵過程的初期，菌體會自主誘導相關的酶系（enzyme pool）。因此引入調節器模型來描述酶系建立過程[24]，見圖2。圖2中一階閉環調節器的輸入是比底物轉運速率最小值或初始值，k1和 k2表征了相關酶系的建立過程對比底物消耗速率過渡過程的影響，模型中引入μ的負反饋考慮的是菌體生長對酶系比濃度的稀釋作用，K是低通開關[25]。

圖2　黑曲霉比底物消耗速率調節器模型Fig.2　Diagram of extended regulator model

調節器模型的數學描述見式（6）

反應速率r1～r10采用Monod模型描述

胞內酶濃度的濃度變化為

其中

2.3宏觀狀態變量

根據物料守恒定律及微生物反應動力學原理分別可得出下列模型。

（1）菌體生長模型

式中，μ是細胞的比生長速率。

（2）底物消耗模型

（3）產物生成模型

式中，Pr為比產物生成速率。在發酵初期，檸檬酸積累較少，隨著黑曲霉的生長，胞外pH降低，檸檬酸開始快速積累[21]，表現為與菌體生長和濃度相關聯

3　模型驗證

模型驗證數據為某檸檬酸工業發酵過程數據，底物和產物測定采用高效液相色譜法（HPLC）。

圖3　宏觀狀態變量的模型仿真結果與測量值的對比Fig.3　Comparison between model simulation and measurements

圖4　胞內酶濃度的模型仿真結果與測量值Fig.4　Specific intracellular enzyme levels

模型中共有78個參數，其中7個敏感參數通過差分進化算法進行辨識，結果見表3。其余71個相對不敏感的參數均從文獻中查閱得到[3,26-31]。圖3和圖4是模型仿真結果與實測值對比，圖中橫坐標為發酵時間。

表3　參數辨識結果Table 3　Identified model parameters

由圖3和圖4可知，模型可以較好地描述發酵過程中黑曲霉濃度的變化，并與底物和產物的實測數據相吻合。胞內酶濃度變化顯示，在發酵初期，經酶系誘導，各代謝途徑通量快速上升，在產酸期，糖酵解途徑維持較高水平，三羧酸循環受到明顯抑制，二氧化碳固定作用明顯，從而形成了檸檬酸的積累。

4　結　論

本文分析了黑曲霉代謝途徑，建立了檸檬酸發酵過程控制論模型，該模型可以較準確地描述黑曲霉生長、底物消耗、產物生成，同時胞內酶濃度的仿真結果展示了發酵過程中檸檬酸的積累機制，可結合組學信息用于解析檸檬酸高產機理。

符號說明

Ci——中間代謝物的比濃度，g·(g DW)-1

e1～e12——與通路p1～p12對應的胞內酶濃度，

g·(g DW)-1

Kj——反應1～12的飽和常數，g·(g DW)-1

KS——底物轉運模型中的米氏常數，g·L-1

k1，k2——調節器模型參數，調節轉運時間，h-1

P——產物濃度，g·L-1

p1～p12——簡化代謝網絡中的通路

rP——比產物生成速率，g·(g DW)-1·h-1

rS——比底物消耗速率，g·(g DW)-1·h-1

r1～r12——通路p1～p12的比反應速率，g·(g DW)-1·h-1

S ——發酵液中的底物濃度，g·L-1

uj——控制酶合成速率的控制變量

vj——控制酶活性的控制變量

X ——生物物質濃度，g DW·L-1

Y ——得率系數

α，β ——模型參數

μ ——比生長速率，h-1

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Cybernetic modeling for citric acid fermentation by Aspergillus niger

HAN Lingyu1, CHENG Baokun1, ZHENG Xiaomei2, SUN Jibin2, YUAN Jingqi1
(1Department of Automation, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;2Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

Aspergillus niger fermentation is the main way for the industrial production of citric acid. Modeling of Aspergillus niger from the perspective of cybernetics is significant for better understanding the metabolic behavior of this industrial microorganism. The metabolic pathways in Aspergillus niger during citric acid fermentation are investigated. Based on the simplified metabolic network, a cybernetic model describing the balance of intracellular metabolites and enzyme levels is constructed. Meanwhile, a first-order closed-loop regulator model is used to describe the transient enzyme pool establishment shortly after the inoculation. Combining with the bioreactor model, it is found that model simulations of intracellular enzyme concentrations are in coincidence with the measurements qualitatively, while the macroscopic state variables (biomass concentration, substrate concentrate and product concentrations) agree well with the offline assays.

Aspergillus niger; citric acid; cybernetic; kinetic model; intracellular enzyme concentration; metabolism simulation

date: 2014-12-18.

Prof. YUAN Jingqi, jqyuan@sjtu.edu.cn

supported by the Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology/ Chinese Academy of Science and the Doctoral Program of Higher Education (20110073110018).

10.11949/j.issn.0438-1157.20141879

TP 273

A

0438—1157（2015）11—4534—06

2014-12-18收到初稿，2015-08-09收到修改稿。

聯系人：袁景淇。第一作者：韓玲玉（1992—），女，碩士研究生。

中國科學院系統微生物工程重點實驗室開放課題；博士學科點專項科研基金項目（20110073110018）。