復方燈盞頭痛片提取物的活性篩選*

王亞飛，馮　霞，馬　莉，韓　鋒，高　靜，鄧晉麗

復方燈盞頭痛片提取物的活性篩選*

王亞飛1，馮霞1，馬莉2，3，韓鋒2，3，高靜2，3，鄧晉麗1

（1.天津大學理學院，天津300073；2.天津藥物研究院，天津300193；3.中藥現代制劑與質量控制技術國家地方聯合工程實驗室（天津），天津300193）

［目的］對不同工藝制備的復方燈盞頭痛片提取物進行藥效學比較研究。［方法］采用小鼠水浴甩尾反應實驗、醋酸致小鼠扭體實驗、硝酸甘油致小鼠偏頭痛模型以及利血平低5-HT化小鼠偏頭痛模型，對不同提取工藝所得復方提取物進行藥效學篩選。［結果］3種工藝提取物均能有效提高甩尾潛伏期，抑制小鼠的扭體反應，具有明顯的鎮痛作用，其中以醇提物組效果最為顯著；在硝酸甘油致小鼠偏頭痛實驗中，醇提物高低劑量組均能明顯減少小鼠撓頭次數，水提物及醇水雙提物只有高劑量組可明顯減少小鼠撓頭次數（P＜0.05）；利血平低5-HT化小鼠偏頭痛模型實驗中，3種提取物均可提高腦組織及血液中5-HT的含量，其中以醇提物提升效果最為顯著。［結論］相同劑量的復方醇提物藥效活性優于水提物及醇水雙提物，醇提工藝為其較優提取工藝，可作進一步研究和開發。

提取工藝；復方燈盞頭痛片提取物；偏頭痛；動物模型；鎮痛

偏頭痛是一種臨床最常見的原發性頭痛類型，以發作性搏動性頭痛為特征，發作呈密集性、間歇性［1］。主要表現為一側或雙側頭部跳動，伴有惡心、嘔吐等植物神經癥狀［2］。在中醫學中，偏頭痛屬于“頭風”、“偏頭風”范疇［3］。復方燈盞頭痛片為純中藥制劑，主要由燈盞細辛、川芎、白芷、獨一味等6味中藥組成。君藥燈盞細辛系菊科植物短亭飛蓬的干燥全草，性寒、味苦、微辛，具有散寒解表、祛風除濕、活絡止痛之功效［4］，主治感冒、頭痛、鼻塞、風濕痹痛、癱瘓、小兒疳積、跌打損傷等。川芎、白芷是治療偏正頭痛的常用藥物，常配伍使用，運用廣泛［5-7］。獨一味系唇形科獨一味屬植物，全草入藥，性味甘，苦，平，具有活血祛瘀，消腫止痛之功效，常用于治療各種外科手術后的刀口疼痛、出血、風濕痹痛等，是藏族習用藥材之一。本研究對不同提取工藝復方燈盞頭痛片提取物進行藥效學考察，以期優選出對偏頭痛治療效果顯著的提取工藝，為其進一步開發和利用提供實驗支撐。

1　材料

1.1動物健康KM小鼠，等級為SPF級，體質量為18～20 g，雌雄各半，購于天津市津南區春樂實驗動物養殖場動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK-（軍）2009-003。

1.2藥物燈盞細辛購于云南，經含量測定符合藥典要求。其余各味藥購于天津市中藥飲片廠。

復方醇提物制備：取燈盞細辛等6味中藥，加10倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1 h。醇提液合并，減壓濃縮至濃度為每克含生藥1.40 g的浸膏，備用。

復方水提物制備：取燈盞細辛等6味中藥，加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。乙醇沉淀，取濾液減壓濃縮至濃度為每克含生藥2.27 g的浸膏，備用。

復方醇水雙提物制備：取燈盞細辛等6味中藥，加8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次1 h。醇提液待用。藥渣加8倍量水，煎煮2次，每次1 h。60%乙醇沉淀，濾液與醇提液合并，減壓濃縮濃度為每克含生藥1.5 g的浸膏，備用。

1.3藥品與試劑氯化鈉注射液（河北天成藥業股份有限公司，E13080407）。尼美舒利（天津藥物研究院藥業有限責任公司，130508），以生理鹽水制成0.498 mg/mL溶液。硝酸甘油注射液（每毫升含硝酸甘油5 mg，北京益民藥業有限公司，20121123）。利血平注射液（每毫升含利血平1mg，天津金耀氨基酸有限公司，20100930），乙醇（藥用級），5-羥色胺（5-HT）為Sigma產品，其余化學試劑均為國產分析純。

1.4儀器電子分析天平（AB204-N，Metter Toledo科技有限公司），電子天平（YP3001N，上海精密科學儀器有限公司），調溫電熱套（ZDHW，北京中興偉業儀器有限公司），恒溫水浴鍋（TDA-8002，余姚市東方電工儀器廠），真空干燥箱（82A型，上海市實驗儀器總廠），電動玻璃勻漿機（DY89-I，寧波新芝生物科技股份有限公司），旋轉蒸發器（R501B，無錫市星海王生化設備有限公司），熒光分光光度儀（F95S，上海棱光技術有限公司），秒表（CASIO，HS-3V）

2　方法

2.1小鼠水浴甩尾反應實驗選用閾值合格的KM小鼠80只，隨機均分成8組，雌雄各半，陽性藥（尼美舒利）組按表1所示劑量灌胃給藥；第3～8組為實驗組，分別口服灌胃復方醇提物、水提物及醇水雙提物（給藥劑量見表1），對照組給予等容積生理鹽水。每日1次，連續給藥3 d。于實驗前及末次給藥1 h及3 h分別將小鼠尾尖1.5 cm浸入恒溫水浴中（55±0.5）℃，用秒表記錄鼠尾自浸入水中到出現甩尾動作的時間，作為甩尾反應潛伏期。

2.2醋酸致小鼠扭體反應實驗取健康KM小鼠80只，分組、給藥方法及劑量同2.1項。末次給藥30 min后，各組小鼠均靜脈注射0.7%醋酸溶液（10 mL/kg）［8-11］，記錄注射醋酸溶液后，第2個10 min內的扭體次數。

2.3硝酸甘油致小鼠偏頭痛模型實驗取健康KM小鼠90只，隨機均分成9組，雌雄各半，陽性藥組及實驗組給藥方法及劑量同2.1項，空白對照組和模型組均給予等容積生理鹽水。末次給藥30 min后，除空白對照組外其余各組小鼠均皮下注射硝酸甘油注射液（10 mg/kg），復制實驗性偏頭痛模型，造模后，小鼠出現雙耳發紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數增多等行為癥狀表明偏頭痛動物模型制作成功［12］。記錄注射硝酸甘油注射液后，第2個20 min內小鼠的撓頭次數。

2.4利血平致小鼠偏頭痛模型實驗取健康KM小鼠90只，分組、給藥劑量方法同2.3項，除空白對照組外其余各組小鼠均皮下注射利血平10 mg/kg，連續14 d。從第7天起，實驗組分別灌胃復方醇提物、水提物及醇水雙提物，空白對照組和模型組給予等容積生理鹽水，每日1次，連續給藥7 d，陽性藥對照組實驗當日按表4所示劑量口服灌胃給藥1次。于第14天給藥1 h后，摘眼球取血，而后脫頸椎處死動物，迅速分離腦組織，操作在冰臺上完成。測定時，用勻漿器制備腦組織勻漿液（在冰浴中）。熒光法測定腦組織及血液中5-HT含量［13-14］。

3　結果

3.1對小鼠水浴甩尾反應的影響給藥前各組甩尾潛伏期無統計學差異（P＞0.05）。給藥后各組與對照組比較，3種提取工藝所得提取物均可有效延長小鼠甩尾反應潛伏期，給藥3 h后仍有效，鎮痛效果良好。其中醇提物高劑量組效果最為顯著（P＜0.001），見表1。

表1　復方燈盞頭痛片提取物對小鼠水浴甩尾反應的影響

表1　復方燈盞頭痛片提取物對小鼠水浴甩尾反應的影響

注：與對照組比較，*P＜0.001，#P＜0.01，△P＜0.05。

給藥后不同時間甩尾潛伏期（s）1 h　3 h對照組　—　1.625±0.206　1.62±0.23　1.64±0.23陽性藥組　5×10-3　1.627±0.209　2.28±0.46#　2.25±0.48#醇提物低劑量　0.62　1.632±0.198　1.95±0.35△　2.00±0.35△醇提物高劑量　1.23　1.612±0.214　2.20±0.46#　2.21±0.35*水提物低劑量　0.62　1.634±0.226　1.88±0.36　1.93±0.37水提物高劑量　1.23　1.622±0.210　1.95±0.36△　2.12±0.47△醇水雙提物低劑量　0.62　1.634±0.254　1.93±0.45　1.93±0.39醇水雙提物高劑量　1.23　1.624±0.206　2.01±0.41△　2.02±0.36△組別　給藥劑量（g/kg）給藥前甩尾潛伏期（s）

3.2對醋酸致小鼠扭體的影響與對照組比較，3種提取工藝提取物均能有效抑制醋酸導致的小鼠扭體反應（P<0.05），具有明顯的鎮痛作用。復方醇提物能顯著抑制小鼠扭體次數（P＜0.05），其中高劑量組效果最顯著（P＜0.01），其余兩種提取工藝只有高劑量組能減少小鼠扭體次數（P＜0.05），見表2。說明復方燈盞頭痛片具有一定的鎮痛效果，醇提物鎮痛效果更顯著。

3.3對硝酸甘油致偏頭痛小鼠撓頭次數的影響造模后各組小鼠較空白對照組均出現前肢頻繁搔頭、爬籠次數增多，說明實驗性偏頭痛小鼠模型制作成功。與模型組比較，復方醇提物可明顯減少硝酸甘油致模型小鼠的撓頭次數（P＜0.05），其中高劑量組效果更顯著（P＜0.01）；復方水提物及雙提物高劑量組可顯著減少小鼠撓頭次數（P＜0.05），低劑量組則無明顯抑制作用。見表3。

表2　復方燈盞頭痛片提取物對醋酸致小鼠扭體的影響（x±s，n=10）

表2　復方燈盞頭痛片提取物對醋酸致小鼠扭體的影響（x±s，n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.01，#P＜0.05。

組別　給藥劑量（g/kg）　扭體數（次）對照組　—　20.3±9.7陽性藥組　5×10-3　9.7±4.6*醇提物低劑量　0.62　10.3±4.2#醇提物高劑量　1.23　7.6±3.9*水提物低劑量　0.62　13.1±6.9水提物高劑量　1.23　10.7±5.7#醇水雙提物低劑量　0.62　14.7±6.6醇水雙提物高劑量　1.23　10.8±4.6#

表3　復方燈盞頭痛片提取物對硝酸甘油致偏頭痛小鼠撓頭次數的影響

表3　復方燈盞頭痛片提取物對硝酸甘油致偏頭痛小鼠撓頭次數的影響

注：與模型組比較，*P＜0.01，#P＜0.05。

組別　給藥劑量（g/kg）　撓頭數（次）空白對照組　—　9.1±3.95*模型組　—　23.7±10.10陽性藥組　5×10-3　13.6±6.00#醇提物低劑量　0.62　15.1±7.60#醇提物高劑量　1.23　12.3±6.80*水提物低劑量　0.62　18.9±9.10水提物高劑量　1.23　15.7±5.60#醇水雙提物低劑量　0.62　19.1±9.00醇水雙提物高劑量　1.23　15.8±5.70#

3.4對偏頭痛模型小鼠5-HT水平的影響與模型組比較，3種提取工藝所得復方提取物均能顯著升高模型小鼠腦內及血液中的5-HT水平。其中醇提物對5-HT水平的影響最為明顯（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），見表4。

表4　對偏頭痛模型小鼠腦內及血中5-HT的影響

表4　對偏頭痛模型小鼠腦內及血中5-HT的影響

注：與模型組比較，*P＜0.001，#P＜0.01，△P＜0.05。

血液中含量（μg/g）模型組　-　0.032±0.018　0.082±0.025陽性藥組　5×10-3　0.068±0.022#　0.145±0.044#醇提物低劑量　0.62　0.057±0.0201△　0.135±0.048#醇提物高劑量　1.23　0.070±0.029#　0.153±0.046*水提物低劑量　0.62　0.048±0.0233　0.132±0.050△水提物高劑量　1.23　0.058±0.021△　0.151±0.048#醇水雙提物低劑量　0.62　0.050±0.020　0.134±0.049△醇水雙提物高劑量　1.23　0.056±0.019△　0.149±0.051#組別　給藥劑量（g/kg）腦中含量（μg/g）

4　討論

中藥復方復雜的有效成分，一直困擾科研工作者對其作用機制進行闡明，即使作用機制較為清楚的復方，其藥效也是多種有效成分協同作用的結果。偏頭痛屬于中醫“頭風”的范疇，為內傷頭痛。中醫辨證認為，頭風是由風火上攻頭目、痰濁中阻、瘀阻經絡、血行不暢引起的，一般頭風病的發作期以風、痰、瘀、熱為主，緩解期則多見虛和瘀［15-18］。本方以行氣通脈，祛風、平肝息風、化瘀止痛為原則諸藥合用［19］，觀察其對偏頭痛模型小鼠的藥效學影響。

本實驗初步考察了復方燈盞頭痛片不同工藝提取物的鎮痛作用及對實驗性偏頭痛模型小鼠的影響。在小鼠水浴甩尾及醋酸致小鼠扭體鎮痛實驗中，不同工藝提取物均表現出鎮痛作用，其中以醇提物組鎮痛作用最為明顯。硝酸甘油致小鼠偏頭痛模型實驗顯示，復方醇提物高低劑量組均能明顯減少小鼠撓頭次數，水提物和醇水雙提物只有高劑量組可明顯減少小鼠撓頭次數，低劑量組對小鼠撓頭次數均無明顯抑制作用。不同復方提取物能顯著提高腦組織及血液中5-HT的含量，其中以醇提物提升效果最為顯著。

提取工藝是影響中藥復方制劑藥效好壞的影響因素之一。不同提取工藝復方燈盞頭痛片提取物對小鼠偏頭痛影響的結果顯示，復方燈盞頭痛片醇提物藥效活性優于另外兩種工藝提取物，鎮痛作用較強，對偏頭痛的治療效果更優。不同提取工藝的藥效差異主要是提取物有效成分的含量和多個有效成分間比例的差別，本研究下一步擬采用HPLC、UV-VIS等技術，對不同提取工藝提取物的有效成分進行分析，并結合其他藥效學指標、生產成本等，在本實驗結果的基礎上，進一步篩選優化出一條合理有效的復方燈盞頭痛片提取路線。

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Comparative studies on pharmacological effects of compound erigeron headache tablet with different extraction techniques

WANG Ya-fei1，MA Li2，3，HAN Feng2，3，GAO Jing2，3，DENG Jin-li1
（1.School of Science，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193，China；3.National&Local United Engineering Laboratory of Modern Preparation and Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine（Tianjin），Tianjin 300193，China）

［Objective］To compare pharmacological properties of different extracts of compound erigeron headache tablet and to select the optimum extracting technique.［Methods］The method of acetic acid twisting and thrilling test were adopted in the research of analgesic effect，one mice migraine model was induced by nitroglycerin（10 mg/kg）and the other was duplicated by subcutaneous injection of reserpine，and then were treated with the extracts of compound.［Results］The extracts of compound erigeron headache tablet could significantly prolong the latency of thrilling，also could decrease the number of twisting，and had an obvious analgesic effect，the alcohol extracts in high dosage group were more effective than the others.The experiments of therapeutical effect showed that the alcohol extracts could both reduce the number of scratching.Water extracts and alcohol-water extracts only worked in high dosage group（P＜0.05）.The extracts could significantly increased 5-HT level，and the alcohol extracts group were more effective than the others.［Conclusion］The pharmacological effects of alcohol extracts are better than the other two in the same dose，the extraction method of alcohol is the optimum extraction technique.It is worth further researching and developing.

extraction technique；compound erigeron headache tablet；migraine；mice models；analgesic

R285.6

A

1673－9043（2015）02－0100-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.09

天津市科技支撐計劃（12ZCDZSY19100）。

王亞飛（1990-），女，碩士，主要從事中藥新藥方向的研究。

馮霞，E-mail:f_x@tju.edu.cn.com；馬莉，E-mail:zhihua504@163.com。

（2014-10-25）