生物節律紊亂影響糖尿病腎病大鼠“氣陰虧虛”病機的初步探討*

陳剛毅，溫淑婷，林　育，李雯晴，李銘舜，王俊月，溫惠紅，寧偉杰

生物節律紊亂影響糖尿病腎病大鼠“氣陰虧虛”病機的初步探討*

陳剛毅1，溫淑婷2，林育2，李雯晴2，李銘舜2，王俊月3，溫惠紅2，寧偉杰2

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州510405；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣州510405；3.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州510405）

［目的］探討生物節律紊亂對糖尿病腎病大鼠“氣陰虧虛”病機的影響。［方法］選用健康SD雄性大鼠64只，隨機分為4組，每組16只，分別為:空白組、生物節律紊亂組、糖尿病腎病（DN）組、DN生物節律紊亂組。DN組及DN生物節律紊亂組為小劑量多次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液，高脂飼料喂養建立。復制大鼠糖尿病腎病模型后，生物節律紊亂組、DN生物節律紊亂組同時改變光照誘導為生物節律紊亂模型。實驗結束后，觀察大鼠飲水量、尿量及體質量變化情況，檢測大鼠模型血液中的血糖值、24 h尿蛋白定量及環磷酸腺苷（cAMP）與環磷酸鳥苷（cGMP）的表達水平與比值；大鼠腎臟病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色、過碘酸雪夫（PAS）染色觀察病理改變。［結果］1）與空白組相比，DN組與DN生物節律紊亂組的飲水量、尿量、血糖值、24 h尿蛋白定量明顯增多（P＜0.01）；DN組cAMP含量降低（P＜0.05），DN生物節律紊亂組cGMP含量升高（P＜0.05），cAMP/cGMP比值降低（P＜0.01）。2）與DN組相比，DN生物節律紊亂組飲水量、尿量、血糖值明顯下降（P＜0.01），24 h尿蛋白定量明顯增多（P＜0.01），腎臟病理損害嚴重；cGMP的含量升高，cAMP與cGMP的比值降低（P＜0.05）。［結論］生物節律紊亂可通過對機體耗氣傷陰，促進糖尿病腎病進程。

生物節律紊亂；糖尿病腎病；cAMP/cGMP；氣陰虧虛；病機探討

糖尿病腎病（DN）是糖尿病的嚴重并發癥，并由此導致終末期腎臟病，目前，中國DN發病率呈上升趨勢，成為嚴重的公共衛生問題［1］。在臨床中觀察到，DN的證候演變有一定規律。早期以陰虛燥熱為主，中期發展為氣陰兩虛，而晚期則以陰陽兩虛為主［2］。其中，氣陰兩虛是影響DN的發展、轉歸及預后的重要階段。針對此階段進行深入的探究有望揭示DN進展的機制［3-4］。人類歷史正處于工業化進程的加速期，隨著當今社會壓力的增加，人們長期處于熬夜、睡眠不足、晝夜顛倒等不良生活方式，進而打亂人體正常的節律，加速疾病進程［5］。本研究通過觀察生物節律紊亂對DN大鼠氣陰虧虛的分子環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）表達水平的影響，初步探討生物節律紊亂促進DN的病機變化。

1　材料與方法

1.1動物清潔級SD雄性大鼠，體質量180～200g，由廣州中醫藥大學醫學實驗動物中心提供，許可證號：scxk（粵）2013-0092。

1.2主要試劑與儀器鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；大鼠cAMP、cGMP酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；羅氏血糖儀（瑞士羅氏公司）；全自動生化分析儀（日立7170）；離心機Centrifuge5424（德國eppendorf公司）；酶標儀MAX 190（美國SPECTRA公司）。

1.3動物的選擇與分組選用健康SD雄性大鼠64只，按隨機數字表法隨機分為4組，每組16只，分別為：空白組、生物節律紊亂組、DN組、DN生物節律紊亂組，分籠飼養，自由攝食、飲水。

1.4糖尿病腎病大鼠的造模DN組及DN生物節律紊亂組采用小劑量多次腹腔注射40 mg/kg的STZ溶液（STZ溶于pH=4.3的0.1 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液），配合高脂飼料喂養復制糖尿病腎病模型［6］，以連續3次檢測血糖＞16.6 mmol/L，24 h尿蛋白排泄＞30 mg為模型復制成功，整個造模周期為8周。

1.5干預措施復制DN大鼠模型后，即實驗第9周開始，生物節律紊亂組、DN生物節律紊亂組同時改變光照時間。將兩組大鼠置于持續黑暗/持續光照各1周的條件下，經歷3次環境顛倒循環共6周。空白組和DN組任置于正常12 h光照/12 h黑暗（光照08∶00～20∶00，黑暗20∶00～08∶00）條件下。

1.6標本采集與指標檢測各組動物分別在第1周（實驗前）和第14周（實驗后）安置于代謝籠中收集24 h尿液，全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白排泄量，同時檢測大鼠血液中的血糖值。實驗結束，各組大鼠用水合氯醛溶液（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，采用大鼠心臟取血法采集血液，EDTA促凝管收集，以3 000 r/min離心5 min，分離血漿。cAMP和cGMP的含量檢測采用ELISA法，顯色后用酶標儀在450 nm測定光密度（A）值，零孔設為對照，據各孔A值計算待測值的含量。實驗結束時切取大鼠腎臟，去掉被膜，用冷生理鹽水灌洗以除去腎臟血管內血液，固定于4%多聚甲醛，取少量腎組織常規制片，蘇木精-伊紅染色法（HE）及過碘酸雪夫（PAS）染色，光鏡放大200倍觀察腎組織病理變化。

1.7統計方法采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料均以均數±標準差表示。組內自身前后比較采用配對t檢驗。組間比較時，若符合偏態分布則采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠一般狀況空白組小鼠反應正常靈敏，體毛平伏有光澤；生物節律紊亂組小鼠反應較不靈敏，體毛枯萎。DN組在模型成功后出現多飲、多食、多尿癥狀，活動遲緩，體毛稀疏無光澤；DN生物節律紊亂組在成模后亦同時出現多飲多尿癥狀，相比于DN組，伴有飲食及尿量的減少，精神異常萎靡，活動明顯遲緩，體毛枯萎無光澤，便溏。

去除造模失敗和數據不全大鼠后的數據顯示，DN組及DN生物節律紊亂組的大鼠的飲水量、尿量較空白組增加，體質量增長緩慢，變化值較空白組減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；同時，DN生物節律紊亂組的飲水量、尿量較DN組減少，體質量呈負增長趨勢，有差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.2各組大鼠不同時間段血糖測定結果數據顯示，實驗后的DN組及DN生物節律紊亂組的血糖值均較實驗前增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；同時，DN生物節律紊亂組的血糖值較DN組減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表1　各組大鼠飲水量、尿量、體質量變化值的比較

表1　各組大鼠飲水量、尿量、體質量變化值的比較

注：與空白組比較，*P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.01。

分組　n飲水量（mL）　尿量（mL）　體質量變化值（g）空白組　11　49.00±18.23　8.33±6.52　77.40±18.92生物節律紊亂組　11　52.31±14.67　8.88±6.14　44.31±28.35* DN組　10 272.00±58.27*　88.80±22.05*　49.80±18.36* DN生物節律紊亂組　6 158.33±51.64*△39.50±28.90*△-24.20±12.24*△

表2　各組大鼠血糖值mmol/L

表2　各組大鼠血糖值mmol/L

注：與本組實驗前比較，#P＜0.01；與空白組比較，*P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.01。

分組　n　實驗前　實驗后空白組　11　5.01±0.75　06.07±0.66生物節律紊亂組　11　5.14±0.68　05.99±0.80 DN組　10　5.64±0.93　35.28±7.87*#DN生物節律紊亂組　6　6.32±0.66　17.92±7.08*#△

2.3各組大鼠24 h尿蛋白測定結果數據顯示，實驗后的DN組及DN生物節律紊亂組的24 h尿蛋白排泄量均較實驗前增加，差異有統計學意義（P＜0.01），同時，DN生物節律紊亂組的24 h蛋白尿排泄量較DN組明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3　各組大鼠24 h尿蛋白排泄量mg

表3　各組大鼠24 h尿蛋白排泄量mg

注：與本組實驗前比較，#P＜0.01；與空白組比較，*P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.01。

分組　n　實驗前　實驗后空白組　11　6.90±3.23　11.72±6.91生物節律紊亂組　11　5.77±2.52　13.07±4.18 DN組　8　2.85±0.69　23.71±5.82#* DN生物節律紊亂組　6　4.20±2.16　41.00±8.21#*△

2.4各組大鼠腎臟組織病理形態比較結果顯示：空白組腎小球結構及體積正常，腎小球系膜細胞及基質正常無增生；生物節律紊亂組腎小球體積較空白組大，腎小球系膜細胞及基質略有增生；DN組腎小球體積增大，系膜增生明顯，系膜細胞增多，腎小管上皮細胞腫脹；DN生物節律紊亂組腎小球體積明顯肥大，系膜增生更加明顯，系膜細胞明顯增多，腎小管上皮細胞較DN組更加腫脹。見圖1、圖2。

2.5各組大鼠cAMP、cGMP、cAMP/cGMP含量變化

與空白組相比，DN組大鼠cAMP含量降低（P＜0.05）；DN生物節律紊亂組大鼠cGMP含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05），cAMP/cGMP比值降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；同時，與DN組相比，DN生物節律紊亂組cAMP升高，cGMP的含量升高，cAMP/cGMP比值降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

圖1　各組大鼠腎臟組織病理形態比較（HE染色×200）

圖2　各組大鼠腎臟組織病理形態比較（PAS染色×200）

表4　各組大鼠血清環核苷酸含量變化比較

表4　各組大鼠血清環核苷酸含量變化比較

注：與空白組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.05。

分組　n cAMP（nmol/L）cGMP（nmol/L）cAMP/cGMP空白組　11 90.63±10.14　23.20±4.39　3.99±0.62生物節律紊亂組　11 83.80±08.70　24.88±5.07　3.54±0.98 DN組　10 81.36±11.51*23.39±5.48　3.71±1.21 DN生物節律紊亂組　6 97.49±33.34△　38.68±15.75*△2.76±0.94#△

3　討論

DN目前逐漸成為維持性透析的主要原因，最終引起尿毒癥，進行病因病機的探究，是防治DN的基礎和關鍵。DN屬于中醫“消渴”、“虛勞”病的范疇，其基本病機是本虛標實，陰虛燥熱，病變臟腑以腎為主［7］。消渴證候的一般演變規律是，初起常以津傷燥熱為主，隨著病程的進展，引起陰精虧損，進而出現耗氣傷陰，病情日久則演變為陰陽兩虛之證［2，8］。

當今激烈的社會競爭使人們的工作和生活在巨大的壓力下，越來越多的人生活不規律，從而破壞內在生物節律［9］。生物節律紊亂屬于中醫病因“起居無節”的范疇，本課題組既往的文獻研究結果提示［10］，“起居無節”常表現為晝日過勞，夜不靜息，其通過影響人體的氣血功能，導致機體臟腑功能受損，促進疾病的發生與發展。在DN的發展中，生物節律紊亂極有可能加重氣陰虧虛這一發展進程。

現代生物醫學的迅速發展有助于解開“氣陰虧虛”的生物學本質。動物實驗顯示，在糖尿病“氣陰虧虛”階段，大鼠飲食量、尿量比糖尿病初期階段減少，體質量增長緩慢［11］。1971年，Sutherland EW教授發現cAMP作為細胞內的第二信使調節細胞的生理活動與物質代謝［12］。cAMP、cGMP在細胞代謝及多種生理效應的體現中具有關鍵的作用。1973年，美國生物學家Goldberg根據cAMP、cGMP這一對環核甘酸對細胞功能的相互對抗、相互制約，保持一定比例關系和相對平衡作用，提出了“陰陽學說與cAMP和cGMP雙向調節關系的假說”，認為這可代表“陰陽學說”物質基礎［13］。較多研究表明，不論是脾氣（陽）虛弱或腎陽衰微，均有cAMP的表達降低，cGMP值高于正常，cAMP/cGMP比值較正常值低［14］。而在陰虛時，主要是cAMP含量升高，不一定伴有cAMP/cGMP比值升高［15］。

光線對生物節律的影響至關重要［16］，本研究通過光暗顛倒改變糖尿病腎病大鼠的外界自然光照環境模擬DN生物節律紊亂模型，發現生物節律紊亂影響DN大鼠飲食量、尿量及體質量的增長，增加DN大鼠腎臟組織病理改變，同時DN生物節律紊亂組的24 h尿蛋白排泄量較DN組上升，由于蛋白尿的多少在一定程度上反應DN的嚴重程度［17-18］，提示生物節律紊亂可以促進糖尿病腎病“氣陰虧虛”進程的發展。DN大鼠的cAMP相較空白組降低，提示在糖尿病腎病后期，“耗氣”這一病機更加嚴重。同時，生物節律紊亂DN大鼠相較DN大鼠的cAMP值升高，cGMP值升高，cAMP/cGMP比值降低，提示在糖尿病腎病進程中，生物節律紊亂將通過“耗氣傷陰”這一病機過程加重DN的“氣陰虧虛”，進而加重DN惡化及腎臟纖維化。具體引起cAMP/cGMP變化的分子機制值得進一步的探索。

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Preliminary mechanism study of disruption of chronobiological rhythm promoting diabetic nephropathy through“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis:verification in animal experiments

CHEN Gang-yi1，WEN Shu-ting2，LIN Yu2，LI Wen-qing2，LI Ming-shun2，WANG Jun-yue3，WEN Hui-hong2，NING Wei-jie2
（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

［Objective］To observe the effect of“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis in chronobiological rhythm disordered diabetic nephropathy rats.［Methods］Sixty-four Male Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into normal control group，chronobiology disorder group，diabetic nephropathy（DN）group，and DN chronobiology disorder group（n=16 in each group）.DN rats and chronobiology disorder DN rats were injected intraperitoneally with a low dose streptozotocin（STZ）dissolved in saline sodium citrate（SSC）repeatly and fed with high-fat food.After establishing DN models in eight weeks，chronobiology disorder were induced by changing illumination rhythm in chronobiology disorder rats and DN chronobiology disorder rats for six weeks.The drinking volume，urine volume and the change of weight were recorded.The blood glucose，24 h urinary protein excretion，theratio of cAMP and cGMP were measured，then，to observe the pathological changes of the kidney，histology of the kidney sections stained with hematoxylin-eosin and Periodic Acid-Schiff were used.［Results］①Compared with those in control group，the drinking volume，urine volume，blood glucose，24 h urinary protein excretion significantly increased in DN group and DN chronobiology disorder group（P＜0.01），the expression of cAMP decreased in DN group（P＜0.05，the expression of cGMP increased（P＜0.05）and the ratio of cAMP and cGMP significantly decreased（P＜0.01）in DN chronobiology disorder group.②In contrast to the mice in DN group，the drinking volume，urine volume and blood glucose significantly decreased and 24h urinary protein excretion significantly increased（P＜0.01），the results of renal pathological showed developed renal lesions，the expression of cGMP increased and the ratio of cAMP and cGMP decreased（P＜0.05）in DN chronobiology disorder group.［Conclusion］The disruption of chronobiological rhythm may promote diabetic nephropathy through“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis.

disruption of chronobiological rhythm；diabetic nephropathy；the ratio of cAMP and cGMP；deficiency of Qi and Yin；pathogenesis discussion

R587.1

A

1673－9043（2015）02－0091-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.07

廣東省大學生創新實驗資助項目（1057213003）。

陳剛毅（1975-），男，副主任醫師，研究方向為糖尿病腎病臨床與基礎研究。

溫淑婷，E-mail:wsttingzi@163.com。

（2014-11-05）