適用于不同產地半夏藥材的特異性引物PCR鑒定分析方法

陳蓉，吳成麗，鄧赟，卞金輝

適用于不同產地半夏藥材的特異性引物PCR鑒定分析方法

陳蓉1，吳成麗1，鄧赟2，卞金輝2

目的：通過特異性引物PCR技術，建立不同產地半夏藥材通用的聚合酶鏈式反應（PCR）鑒別法。方法：提取不同產地半夏藥材的基因組DNA，利用特異性引物對基因組DNA進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增結果進行分析。結果：所設計的引物能夠特異性地擴增出半夏的目的DNA，并適用于全國9個主要不同產地半夏藥材的檢測。結論：該方法具有較強的特異性和普適性，適用于半夏藥材的真偽性鑒別。

半夏；特異性引物；PCR

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata （Thumb.）Breit.的干燥塊莖，中醫認為半夏具有降逆止嘔，燥濕化痰，消痞散結的功效，目前被應用于藿香正氣水、藿香正氣液等藿香正氣系列產品中，具有良好的臨床療效［1，2］。由于商業需求量大，加之巨大經濟利益的驅使，目前中藥市場上充斥著大量半夏的混偽品如虎掌半夏、水半夏、天南星［3］等。由于天南星科植物缺乏特征的理化特性，利用傳統的化學分析方法難以鑒別半夏藥材及其混偽品。隨著分子生物學技術的發展，李萍等利用RFLP技術成功地將川貝母和其他貝母類藥材進行了鑒別［4，5］，Peng Xiaoxiao等建立了PCR-RFLP鑒別金銀花的DNA分子鑒定方法［6］，《中國藥典》也收錄了烏梢蛇和蘄蛇的特異性引物聚合酶鏈式反應（PCR）鑒別法［7］。基于此，本文建立了半夏藥材的特異性引物PCR鑒定法，并對來自全國各主要半夏產地的半夏藥材進行了分析鑒定。

1　材料和方法

1.1材料

不同產地的半夏藥材及其混偽品虎掌半夏、水半夏、天南星由太極集團提供并鑒定；半夏對照藥材購自中國藥品生物制品鑒定所；DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司，EasyTaq系列，目錄號AP111； Roche dNTP 購自成都奧克生物技術有限公司；核酸染料購自北京百泰克公司，GELVIEW系列，目錄號EP1501；引物由上海生工生物工程公司合成并純化。

1.2 基因組DNA的提取

將半夏藥材用一次性手術刀片，切去表面易被污染部分，刮取中間干凈部分并碾成粉末，照CTAB法［8］提取，置4℃冰箱備用；同法提取半夏混偽品及半夏對照藥材DNA作為聚合酶鏈式反應模板。

1.3引物設計

從genbank下載半夏、虎掌半夏、水半夏、天南星的ITS序列，序列號分別為：AF469036.1、AF469040.1、AM777883.1和JF975897.1同時利用Mega軟件對序列進行比對分析，選取半夏特異性位點，按照引物設計黃金法則設計引物為BP：5’-GGGAGACTCCCGACGATCGCA，BRP:5-GCCGCACGGACGGATGGAT。

1.4聚合酶鏈式反應

將提取的DNA模板進行PCR擴增，擴增采用50 μL體系，其中包括10×Taq buffer 5μL； Taq酶2.5個單位；正向引物0.25μM； 反向引物0.25μM；dNTPs 0.2 mM；基因組DNA模板1μL；滅菌水補足50μL。PCR反應程序：95℃解鏈3分鐘；94℃變性30秒，62℃復性30秒，72℃延伸30秒，循環30次；72℃延伸5分鐘，得擴增樣品。

1.5PCR擴增產物檢測

取擴增產物5 μL加1μL 上樣緩沖液于2%瓊脂糖凝膠電泳7分鐘后，在瓊脂糖凝膠成像系統中檢測。

2　實驗結果

所設計的特異性引物只能擴增出半夏的特異性條帶，而其混偽品種在相同位置均沒有擴增條帶，見圖1。

圖1　引物特異性考察

半夏引物對全國9個半夏產地的半夏藥材均能擴增出目標條帶，并與半夏對照藥材在相同位置具有相同的條帶，見圖2。

圖2　不同產地藥材擴增結果

3　討論

實驗結果表明所設計的半夏引物能且僅能擴增出半夏特異性目的條帶，說明該引物具有高度特異性，可以從半夏及其混偽品種中特異性的檢測出半夏的存在。全國9個半夏產地的半夏藥材均能擴增出目的DNA條帶，說明該引物具有良好的普適性，對各地區所產的半夏藥材均能成功檢出。半夏藥材作為大宗常用藥材，由于其缺乏特征的理化性質，目前對其質量控制還沒有特異性的方法，僅憑經驗鑒別誤差大，人力資源有限，本文提供了一種能夠快速準確鑒定半夏藥材真偽性的方法，如能加入藥典，廣泛應用，對保證中藥臨床用藥的安全性和有效性，以及推進中藥的現代化、國際化都具有非常重要的意義。

［1］卿玉玲，孫克宏，鄭飛鳴，等.藿香正氣液治療胃腸型感冒臨床觀察［J］.重慶醫學，2006，35（06）:548.

［2］伍韶容.藿香正氣液治療小兒胃腸型感冒的療效觀察［J］.北方藥學，2015，12（03）:89.

［3］唐曉晶.DNA分子標記在中藥材鑒定中的應用研究［D］.北京:中國中醫科學院，2006.

［4］Wang C. Z.，Li P.，Ding J. Y.，et al.Simultaneous identifi cation of Bulbus Fritillariae cirrhosae using PCR-RFLP analysis［J］. Phytomedicine，2007，14（9）:628.

［5］徐傳林，李會軍，李萍，等.川貝母藥材分子鑒定方法研究［J］.中國藥科大學學報，2010，41（03）:226.

［6］Peng X.，Li W.，Wang W.，et al.Identification of Lonicera japonica by PCR-RFLP and allele-specific diagnostic PCR based on sequences of internal transcribed spacer regions［J］. Planta Med，2010，76（5）:497.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:72，349.

［8］Chen Rong，Dong Juan，Cui Xin，et al.DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines［J］.Sci. Rep.，2012，2.

（責任編輯：蔣淼）

A general detection method of Banxia from different habitats based on specifi c primers PCR

CHEN Rong1, WU Chengli1, DENG Yun2, BIAN Jin-hui2
(1. School ofEthnomedicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: Establish a general detection method of Banxia from different habitats based on specifi c primers PCR. Method: Genetic DNA of Banxia from different habitats was extracted and amplified by specific primers. The PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis. Result: The target DNA of Banxia was successfully detected in the samples from 9 habitats. Conclusion: This method is specifi c and can be generally used in the identifi cation of Banxia.

Banxia； specifi c primers； PCR

R 284.1

A

1674-926X（2015）06-005-02

四川省教育廳理工科一般項目（14ZB0077）；成都中醫藥大學科技發展基金（ZRQN1434）；四川省科技廳項目（2014SZ0071-4）

1.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都611137 2.成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都 611137

陳蓉（1987-），女，碩士，助教，主要從事中藥DNA分子鑒定研究Tel:028-61800094Email:CDTCM_CR@163.com

卞金輝（1975-），男，副教授，主要從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究Tel:028-61800127Email:bianjinhui1975@126.com

2015-09-12