八正散對腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR與Ki-67表達研究

尤耀東，黃曉朋，廖婷婷，俞旭君，陳曉洋，常德貴

八正散對腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR與Ki-67表達研究

尤耀東，黃曉朋，廖婷婷，俞旭君，陳曉洋，常德貴

目的：探討八正散對腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR、Ki-67影響機制。方法：以腺性膀胱炎模型大鼠為研究對象，隨機分為空白組、模型組、對照組、八正散高、中、低劑量組，對照組給予羥基喜樹堿（3 mg/kg·d）給予膀胱灌注，八正散高、中、低劑量組分別給予同體積八正散液（生藥濃度0.84、0.42、0.21 g·mL-1），每日2次，灌注/灌胃連續2周。HE染色觀察膀胱病理變化，免疫組織化學法觀察膀胱組織中的α1D-AR、Ki-67表達。結果：各組之間比較α1D-AR含量并無明顯差異；與模型組比較，高劑量組、對照組能夠下調Ki-67含量。結論：八正散可以有效改善腺性膀胱炎模型大鼠膀胱病變程度，推測與下調Ki-67含量有關。

腺性膀胱炎；八正散；α1D-AR；Ki-67蛋白

腺性膀胱炎（cystitis glandularis，CG）是一種較特殊的膀胱上皮增生性和化生性病變，隨著人們生活方式和環境的改變，泌尿外科腔內技術的發展以及病理診斷技術的提高，CG的檢出率呈逐年增高的趨勢。臨床CG發病率約為0.9%～1.9%［1］。多數研究者認為CG與膀胱癌之間有一定相關性，是膀胱尿路上皮癌的一種癌前病變［2］。CG已嚴重威脅著患者的健康。

1　儀器及試劑

1.1材料

成年雌性健康SD大鼠60只，體重（240±25）g，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供，生產合格證號：SCXK（川）2013-15。八正散煎劑按車前子、瞿麥、萹蓄、滑石、梔子、炙甘草、木通、大黃八味藥各9g計；戊巴比妥鈉5g（北京普博斯生物）；羥基喜樹堿注射劑（規格5mL:5mg，哈爾濱三聯藥業有限公司，H20033506）；大腸埃希桿菌種（ATCC 25922上海北諾生物科技有限公司）。

1.2主要試劑及設備

Ki67蛋白抗體（批號：bs-2130R，兔多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司）；α1D-AR（批號：bs-1063R，兔多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（批號：13152A11）；辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素（HRP/A-V）（批號：13152A11）；封閉用正常山羊血清（批號：13152A11）；顯色劑：濃縮型DAB試劑盒（批號：K135925C），以上試劑來自北京中山金橋生物有限公司；全自動封閉式組織脫水機TSJ-Ⅱ型：（上海五相儀器儀表有限公司）；病理組織漂烘儀PHY-Ⅲ型（北京世紀科信科學儀器有限公司）；分光光度儀（博威興業科技發展有限公司）等。

2　方法

2.1造模及給藥

大鼠適應性喂養1周后，將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、對照組及八正散高、中、低劑量組各10只。參照易憬等［6］、位志峰等［7］造模方法。除空白組外，其余各組采用大腸埃希菌溶液（105～109CFU/100wL濃度），每隔2天灌注雌性SD大鼠膀胱以誘導產生腺性膀胱炎。45天后，空白組及模型組給予生理鹽水灌胃，每日2次。對照組給予羥基喜樹堿（3 mg/kg·d）給予膀胱灌注，八正散高、中、低劑量組分別給予同體積八正散液（生藥濃度0.84、0.42、0.21 g·mL-1），每日2次，灌注/灌胃連續2周。

2.2觀察及檢測

2.2.1一般觀察 每日巡查，觀察并記錄大鼠一般活動如飲食量、飲水量，大鼠毛色、糞便形狀等。

2.2.1膀胱病理觀察 灌注/灌胃2周后處死大鼠，觀察大鼠膀胱大體情況，10%甲醛溶液固定膀胱組織。進行膀胱組織HE染色切片固定，在高倍鏡視野下觀察組織切片，記錄并分析。

離衢州不遠的南北群山，四十九軍王鐵漢部，七十四軍王耀武部早已布下重兵，只等日軍合圍衢州，再來個南北夾擊反包圍，到那時，他陳頤磊的八十六軍將來個中心開花，聚殲日軍從華東、華北拼湊而來的十萬驕兵。

2.2.2α1D-AR、Ki-67檢測 采用S-P法，根據組織細胞膜、細胞漿或細胞間質等表達的不同顏色，來判斷膀胱組織免疫組化表達情況，結果進行圖像采集及分析。

2.3統計學分析

應用SPSS17.0 統計分析軟件對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），數據以均數±標準差表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1一般活動

造模各組大鼠均有不同程度的攝食減少，惡寒倦臥，反應遲鈍，少動，毛發枯黃等現象。上述情況在八正散灌胃及羥基喜樹堿灌注后逐漸開始改善。

3.2膀胱病理觀察

空白組膀胱粘膜、肌層、漿膜三層完好，未見變性、壞死及炎細胞浸潤，膀胱黏膜組織黏膜光滑，顏色均一淡紅。模型組膀胱三角區及黏膜固有層大量炎細胞浸潤，間質水腫，局灶性壞死，黏膜固有層內有Brunn巢及腺上皮化生。對照組膀胱黏膜固有層少量炎細胞浸潤，間質輕度水腫，局灶性壞死，黏膜固有層內Brunn巢及腺上皮化生較模型組明顯減少。高劑量組病變基本同藥物組。中劑量組病變較模組有所減輕，但炎細胞浸潤程度及黏膜固有層內Brunn巢及腺上皮化情況較灌藥高劑量組略重。低劑量組病變基本同模型組。病理圖示詳見（圖1）

3.3對α1D-AR、Ki-67的影響

表1　 八正散對大鼠膀胱組織α1D-AR、Ki-67平均光密度的影響（x±SD）

結果（表1，圖2、3）顯示：與空白組比較，模型組Ki-67顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，對照組及高劑量組Ki-67顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

4　討論

傳統中醫并無CG一癥，按臨床表現，大多數學者將CG歸屬于中醫“淋證”中熱淋、濕熱淋、血淋等范疇。核心病機總結為濕熱蘊結，膀胱氣化不利。臨床顯示，中醫藥在治療CG方面特色明顯，治療原則上以清熱利濕、利尿通淋為主。八正散源于《太平惠民和劑局方》，是目前治療濕熱淋證的常用經典方之一。方中集木通、滑石、車前子、瞿麥、萹蓄諸利水通淋之品，清利濕熱。伍以梔子清泄三焦濕熱，大黃泄熱降火，甘草調和諸藥而止莖中作痛，加少量燈心可導熱下行。疏利下焦而不專于治下，清瀉合法，組方用藥側重于苦寒通利。以清利膀胱為中心，并行清肺肅上源，降心火利小腸，泄濕熱走大腸，有“疏鑿分消”之巧。體外抗菌實驗表明，八正散對于變形桿菌、大腸桿菌等均有一定的抗菌作用，對金黃色葡萄球菌有較強的抗菌作用［8］。現代藥理研究證實八正散組成諸藥如萹蓄、瞿麥等皆具有不同程度的利尿和抗炎作用［9］。

目前比較統一的CG發病認知為CG的產生與慢性感染、尿路梗阻、排尿功能障礙等所導致的急、慢性膀胱內炎癥密切相關。CG的臨床癥狀常見以尿頻、尿急為主的膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB），與逼尿肌與尿道括約肌不隨意收縮作用有關。腎上腺素能受體（adrenergic receptor，AR）是神經遞質去甲腎上腺素和腎上腺素在靶細胞上的特異性受體，可分為α1、α2、β三類。其中α1-AR主要分布在逼尿肌、膀胱頸等，可使平滑肌收縮，產生排空效應；α1受體功能亢進時則可誘發膀胱逼尿肌不穩定，引起不穩定膀胱。Mally［10］研究發現人類膀胱逼尿肌上α1D-AR約占66%。CG患者膀胱逼尿肌層、三角區肌層α1D-AR表達增加，活性增強，可能是引起CG逼尿肌壓升高、不穩定膀胱的原因之一［11］。通過測定實驗各組對大鼠膀胱組織α1D-AR平均光密度的影響，結果顯示藥物組及八正散組α1D-AR含量與空白組并無明顯差異。Ki67是一種與增殖細胞相關的核抗原，可以準確反映細胞增殖活性，是目前應用最廣泛的細胞增殖標志之一［12～13］。臨床研究顯示定期膀胱灌注化療，可以使膀胱組織中Ki-67含量下調［14～17］。不同類型腺性膀胱炎膀胱鏡下Ki-67基礎表達率明顯不同。Ki-67陽性表達率越高，與正常膀胱黏膜差異性越大［18～20］。通過檢測Ki-67在膀胱組織的表達情況，來判斷臨床膀胱癌的發生、發展、預后等情況［21］。表3結果顯示八正散、羥基喜樹堿能夠下調Ki-67含量。本課題改善大鼠一般情況及病理，可能與下調Ki-67表達相關。

通過本課題研究，我們發現八正散能夠改善腺性膀胱炎大鼠一般情況及大鼠膀胱病理性改變。但并不能下調膀胱組織α1D-AR含量，對逼尿肌功能作用可能通過其他途徑，有待進一步深入研究。此外，藥物組、八正散灌高組能下調Ki-67含量，下調含量程度與八正散的濃度呈正相關量效關系。實驗證實八正散能夠抑制腺性膀胱炎模型大鼠細胞增殖活性，八正散最佳治療劑量有待我們進一步深入研究。

［1］Delnay K M，Stonehill W H，GoldmanH，et al. Bladder histological changes associated with chronic indwelling urinary catheter［J］. JUroU999，161（4）:l106.

［2］Tong R S，LamerT，inlayM，et al. Pelvic lipomatosis associated with proliferative cystitis occurring in two brothers［J］. Urology，2002，59（4）:602.

［3］梁勇，劉建輝，黃鳳鳴，等.120例腺性膀胱炎的診斷和治療［J］.第三軍醫大學學報，2008，30（3）:266.

［4］曾偉，陳志強，葉章群.下尿路感染與腺性膀胱炎關系的臨床研究［J］.臨床泌尿外科雜志，2004（6）:350.

［5］潘英.八正散加減治療膀胱炎35例觀察［J］.實用中醫內科雜志，2006，20 （1）:85.

［6］易憬，熊飛，蘇良平，等.SD大鼠腺性膀胱炎動物模型的建立［J］.臨床外科雜志，2008，16（8）:553.

［7］位志峰，陳志強，葉章群.膀胱內灌注脂多糖建立腺性膀胱炎動物模型的研究［J］.臨床泌尿外科雜志，2006，21（12）:933.

［8］朱雪瓊，朱建龍，林希，等.八正散加減治療腺性膀胱炎療效觀察［J］.中醫藥學報，2010，38（1）:99.

［9］袁海鑫，辛士永，史海軍.八正散合桃核承氣湯治療Ⅲ型慢性前列腺炎的臨床研究.［J］.光明中醫，2014，29（4）:727.

［10］Granados E A，Algaba F，Vicente Rodriguez J. Cystitis glandularis［J］. Arch EspUrol，2009，52（2）:119.

［11］FerrandinaG，RanellettiFO，LaroccaLM，et al.Tamoxifenmodulales the expression of Ki67，apoptosis，and microvessel density in cervical cancer［J］.Clin Cancer Res，2001，7（9）:2656.

［12］Kruse AJ，BaakJP，JanssenEA，et al.Ki67 predicis progression in early CIN: validation of a multivariate progression-risk model［J］.Cell Oncol，2004，26（1-2）:13.

［13］Kruse AJ，BaakJP，JanssenEA，et al.Ki67 predicis progression in early CIN: validation of a multivariate progression-risk model［J］.Cell Oncol，2004，26（1-2）:13.

［14］DuchrowM，GerdesJ，SchluterC，et al.The proliferationassociated Ki67 protein:defi nition in molecular terms［J］.Cell Prolif，1994，27（5）:235.

［15］倪少濱，陳起引，鄧索.P53和bcl-2在腺性膀胱炎及膀胱癌組織中的表達與意義［J］.中華外科雜志，2004，42（8）:500.

［16］方海偉，程躍，蔣軍輝，等.p53、ki67腫瘤標志物在不同分型腺性膀胱炎中的表達及臨床意義［J］.中國中西醫結合外科雜志，2010，16（2）:183.

［17］陳志強，位志峰，葉章群，等.腺性膀胱炎中腫瘤相關指標的改變和臨床分型的探討［J］.中華醫學雜志，2005，86（26）:1842.

［18］何屹，張志根，丁偉，等.腺性膀胱炎CK20、Ki-67表達意義的研究［J］.臨床醫學，2007，27（9）:79.

［19］Fechner G，Perabo G，Schmidt DH，et al.Preclinical evaluation of a radiosensitizing effect of gemcitabine in p53 mutant and p53 wild type bladder cancer cells［J］.Urology，2003，61（2）:468.

［20］Malmstrom PU，Ren ZP，Sheriff A，et al.Early metastatic progres sion of bladder carcinoma:molecular profile of primary tumor and sentinel lymph node［J］.J Urol，2002，168（5）:2240.

［21］Rau AR，Kini H，Pai RR.Morphological evaluation of cystitis glandularis［J］.Indian J PatholMicrobiol.2009，52（2）:203.

［22］張海峰，鄭國有，楊立新.p53、Ki-67基因表達與膀胱癌生物學特性的研究［J］.中國老年學雜志，2005，7（29）:1744.

（責任編輯：陳思敏）

The infl uence of Bazheng San on α1D-AR and Ki-67 expression of rats with cystitis glandularis

YOU Yao-dong, HUANG Xiao-peng, LIAO Ting-ting, YU Xu-jun, CHEN Xiao-yang, CHANG De-gui
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan)

［Abstract］Objective: To study the infl uence mechanism of Bazheng San on α1D-AR and Ki-67 in rats with cystitis glandularis（GC）. Method: GC rat was used and divided into blank group，model group，control group，high，medium and low dose of Bazheng San group. 3mg/kg·d hydroxycamptothecine （HCPT） were given by irrigation of bladder administration to control group. High，medium and low dose （0.84，0.42、0.21 g·mL-1） of Bazheng San group were given Bazheng San by intragastric administration 2 times a day for 2 weeks. Histopathological change of bladder was observed with HE. The expression of α1D-AR and Ki-67 of GC rats bladder was observed with immunohistochemistry. Results:The content of α1D-AR in bladder tissues from CG rats showed no obvious difference among all groups. And immunofl uorescence data revealed that Ki-67 content in the bladder tissues of GC rats in high dose treatment group and control group were down-regulated signifi cantly compared with models. Conclusion: From the experiment we suggest Bazheng San can ameliorate the bladder pathological change in CG rats bladder by reducing the Ki-67 content.

Glandular cystitis； Bazheng San； α1D-AR； Ki-67

R 285.5

A

1674-926X（2015）06-011-03

四川省教育廳科技項目（13ZB0317）；成都中醫

藥大學科技發展基金項目（030018007）

成都中醫藥大學臨床醫學院，四川 成都 610075［作者簡介］尤耀東，講師，主要從事中西醫泌尿男科臨床與

基礎研究

Tel:18908170788Email:yyd110@163.com

常德貴，主任中醫師，主要從事中西醫泌尿男科

臨床與基礎研究

Tel:18980880133Email:cdg998@sina.com

2015-08-13