光動力學(xué)結(jié)合聲動力學(xué)治療對小鼠鱗癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響*

堵建崗，勞力民

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院皮膚科，浙江杭州310009；2.紹興市中心醫(yī)院皮膚科，浙江紹興312030）

光動力學(xué)結(jié)合聲動力學(xué)治療對小鼠鱗癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響*

堵建崗1，2，勞力民1

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院皮膚科，浙江杭州310009；2.紹興市中心醫(yī)院皮膚科，浙江紹興312030）

目的：評價光動力療法（PDT）聯(lián)合聲動力學(xué)療法（SDT）對小鼠鱗癌超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：以鎵卟呤衍生物ATX-70作為光敏劑和聲敏劑，分別用光動力療法、聲動力療法以及兩者聯(lián)合應(yīng)用處理小鼠鱗癌，利用透射電鏡觀察不同時間段取材的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：激光或超聲激活A(yù)TX-70對鱗癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞程度隨取材時間的延長而加劇，聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞破壞程度更明顯。損傷位點(diǎn)主要集中在胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核上，同時還觀察到一些腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凋亡特征。結(jié)論：光動力學(xué)結(jié)合聲動力學(xué)療法比單用腫瘤細(xì)胞破壞程度更明顯，主要通過破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)殺傷腫瘤細(xì)胞，部分通過誘導(dǎo)凋亡殺傷。

光動力學(xué)治療；聲動力學(xué)治療；鱗癌；超微結(jié)構(gòu)

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.005

光動力學(xué)治療（Photodynamic therapy，PDT）是一種新穎的治癌手段，其利用被腫瘤吸收儲留的光敏劑在特定波長激光照射下的光化學(xué)反應(yīng)來選擇殺傷癌細(xì)胞，近幾年該方法在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。由于PDT治療深度約0.5 mm-2.0 mm，僅限于淺表皮膚腫瘤。為了克服PDT的局限性，目前人們致力于研究PDT與化療、熱療、微波療法等聯(lián)合應(yīng)用［1］。利用超聲波激活血卟啉產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的聲動力學(xué)療法（Sonodynamic therapy，SDT）已成為近幾年國內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一［2］，然而對于PDT和SDT聯(lián)合應(yīng)用的研究尚少，特別是形態(tài)學(xué)證據(jù)報道更缺乏。我們以C3H/HeN鼠的移植性鱗癌模型為研究對象，進(jìn)行PDT和STD聯(lián)合應(yīng)用的研究，用透射電鏡觀察治療后瘤細(xì)胞以及微血管內(nèi)皮細(xì)胞早期變化，為探討增強(qiáng)PDT對腫瘤治療作用的新途徑提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1腫瘤模型 腫瘤來自C3Hf/HeN3小鼠自發(fā)產(chǎn)生的鱗癌，傳代維持于C3H/HeN小鼠皮下組織內(nèi)。取健康C3H/HeN鼠30只，鼠齡3-8周，雄雌各半，體重20±2 g，在室溫（18-20℃）條件下養(yǎng)育1周后，無菌條件下將3 mm×3 mm×3 mm腫瘤組織接種于C3H/HeN小鼠背部近左腋窩處，用游標(biāo)卡尺測量種植的腫瘤，當(dāng)腫瘤直徑7 mm-10 mm時進(jìn)行實驗。

1.1.2試劑 光敏劑PH-1126和聲敏劑鎵卟呤衍生物--ATX-70（Toyo Hakka Kogyo Ltd，日本），均用生理鹽水溶解，終濃度1 μg/mL，過濾、滅菌、分裝、避光貯存于-4℃。

1.1.3激光系統(tǒng) 氪離子激光（LKI-2503型，東芝，日本），波長575 nm，光纖輸出垂直照射，光斑直徑2 cm。

1.1.4超聲激發(fā)系統(tǒng) MG442A型超聲發(fā)生儀（Anritsu Electric，日本），超聲頻率1.099 MHz，聲強(qiáng)0.5±0.01 W/cm2，44±1 V，探頭直徑12 mm。

2　實驗方法

將符合上述條件的荷瘤小鼠隨機(jī)分為四組，每組5只。對照組:不作任何處理；PDT組:小鼠于照光前24 h尾靜脈注射PH-1126，使用濃度為5 μg/kg，避光。照射部位局部脫毛，小鼠固定后，用650 nm激光光導(dǎo)纖維頭端對準(zhǔn)腫瘤中心照射30 min，功率密度為75 mW/cm2，總能量44 J/cm2；SDT組:小鼠于治療前36 h尾靜脈注射ATX-70，使用濃度為2.5 μg/kg，避光。1.0 MHz超聲探頭緊貼腫瘤基底，中間敷以超聲導(dǎo)電凝膠，聲照處理10 min，強(qiáng)度0.51 W/cm2。為保持聲照過程中腫瘤組織溫度＜42℃，超聲發(fā)送器附有循環(huán)水冷卻系統(tǒng)；PDT+SDT組，小鼠腫瘤部位先進(jìn)行PDT治療，治療條件同PDT組。激光照射后立即予以超聲波處理，治療條件同SDT組。于治療后即刻、1 h、3 h時分批處死小鼠，瘤組織取材作透射電鏡檢查。所獲腫瘤組織迅速細(xì)切成1.0 mm3的小塊，用0.01 mol/L PBS液清洗后，以2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，逐級酒精脫水，Epon-812包埋，超薄切片，進(jìn)行醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，日立H-300型透射電鏡下觀察腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞超微形態(tài)變化。

3　結(jié)果

3.1腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

3.1.1空白對照組 腫瘤細(xì)胞大小不一（圖1），細(xì)胞核大，核膜清晰，有核切跡，染色質(zhì)著色均勻，核仁數(shù)多為1-2個，細(xì)胞質(zhì)中可見發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離的核糖體，卵圓形的線粒體數(shù)量較多，嵴清晰完整。微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。

圖1　正常對照組：腫瘤細(xì)胞異形性明顯。×2 000Fig.1　Normal control，apparente heteromorphism in Tumor cells.×2 000

3.1.2 PDT組 治療后即刻，數(shù)處可見腫脹的腫瘤細(xì)胞，大小不一，微絨毛縮短，核內(nèi)染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹，嵴模糊，但可見有活性腫瘤細(xì)胞。微血管內(nèi)皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見擴(kuò)張。治療后1 h時（圖2a），腫瘤細(xì)胞膜受損，微絨毛減少或消失，明顯的線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂。內(nèi)皮細(xì)胞病變較前加重，較小空泡形成。治療后3 h時，瘤細(xì)胞膜界限不清，細(xì)胞內(nèi)線粒體瘠模糊或大多消失，空泡形成，數(shù)量較多，胞質(zhì)丟失，出現(xiàn)空區(qū)，并可見核物質(zhì)凝集、細(xì)胞核固縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征（圖2b）。內(nèi)皮細(xì)胞明顯退變，部分壞死。

3.1.3SDT組 治療后即刻腫瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體輕度腫脹變形，部分細(xì)胞核物質(zhì)聚縮深染；1 h時腫瘤細(xì)胞有形變（圖3a），微絨毛減少，瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體輕度腫脹，數(shù)量減少，部分形成空泡化結(jié)構(gòu)，血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見部分線粒體腫脹。治療后3 h時，腫瘤細(xì)胞膜破損，線粒體結(jié)構(gòu)模糊，可見少量凋亡小體（圖3b）。

3.1.4PDT+SDT組 PDT+SDT組與PDT組比較，可見更加嚴(yán)重的損傷，兩者之間超微結(jié)構(gòu)無特殊改變，僅為程度上的差異，如治療后即刻的變化（圖4a），接近于PDT組治療后3h時的改變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)有較多巨大空泡，染色質(zhì)溶解、消失，細(xì)胞器嚴(yán)重變性等為突出表現(xiàn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)空泡更為明顯（圖4b）。

圖3　a.SDT組：腫瘤細(xì)胞輕度水腫，其內(nèi)也可見小空泡；b.SDT組：凋亡腫瘤細(xì)胞較少。×2000Fig.3　a.SDT group，low-grade edema and little cavities in tumor cells；b.SDT group，fewer apoptotic cells×2 000

圖4　a.PDT+SDT組：腫瘤細(xì)胞水腫更明顯空泡更多、更大；b.腫瘤巢旁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)空泡明顯。×2 000Fig.4　a.PDT+SDT group，all the more apparente edema and bigger cavities in tumor cells；b.PDT+ SDT group，apparente cavities in capillary endothelial cells by the side of neoplasms.×2 000

4　討論

以血卟啉類光敏劑為核心的PDT成為繼手術(shù)、放療和化療之外的第四種成熟的腫瘤治療方法，SDT是在PDT的基礎(chǔ)上建立和發(fā)展起來的。1990年Yumita等利用超聲波結(jié)合血卟啉對S100小鼠移植瘤進(jìn)行了抗腫瘤效應(yīng)觀察［3］，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用血卟啉或超聲波僅有微弱抗腫瘤作用，二者結(jié)合對腫瘤細(xì)胞有抑制作用。與激光不同，超聲波是機(jī)械波，可靶向聚焦，具有良好的組織穿透能力。在聲動力學(xué)介導(dǎo)下，聲敏劑能夠特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，對正常組織無明顯損傷作用。

Miyoshi等相繼發(fā)現(xiàn)聲敏劑鎵卟呤衍生物ATX-70在超聲激發(fā)下產(chǎn)生的聲敏化作用能殺傷惡性腫瘤細(xì)胞［4］。Jin等應(yīng)用小鼠的鱗癌模型進(jìn)行PDT和SDT聯(lián)合應(yīng)用的研究［5］，結(jié)果證明聯(lián)合治療導(dǎo)致的組織壞死的深度是單用一種療法的2-3倍，聯(lián)合作用可使PDT作用下不能殺傷的深部腫瘤細(xì)胞，在SDT作用下變性壞死。我們在Jin等實驗基礎(chǔ)上觀察了PDT和SDT治療前后鱗癌細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞超微形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)單純PDT或SDT都對鱗癌細(xì)胞有殺傷作用，但PDT之后進(jìn)行SDT對細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)，并且發(fā)現(xiàn)損傷隨時間推移而加劇。這些結(jié)果提供了PDT與SDT聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)的超微形態(tài)學(xué)證據(jù)，為擴(kuò)大PDT在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了新的實驗基礎(chǔ)。

PDT的生物機(jī)制是以化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，主要體現(xiàn)在兩個方面:①對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用；②通過作用于腫瘤組織的微血管造成血管的完全封閉，使腫瘤組織缺氧和營養(yǎng)枯竭。兩種機(jī)制以何種為主依不同的光敏劑而異。本文實驗發(fā)現(xiàn)，無論P(yáng)DT或SDT治療后鱗癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)都顯示質(zhì)膜、線粒體損傷，并且發(fā)現(xiàn)損傷隨時間推移而加劇；同時也觀察到了腫瘤間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，部分內(nèi)皮細(xì)胞壞死現(xiàn)象。這從形態(tài)學(xué)上證實了PDT和SDT作用的靶位均是細(xì)胞膜和線粒體等膜性細(xì)胞器，對腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的微血管均有殺傷作用。

目前，PDT的作用機(jī)理已得到了普遍認(rèn)可，應(yīng)用比較廣泛。盡管SDT在腫瘤治療領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，由于體內(nèi)作用機(jī)制復(fù)雜［6，7］，對其基礎(chǔ)方面的研究如超聲激活聲敏劑以及破壞腫瘤細(xì)胞的機(jī)理尚不清楚。已有許多實驗證實PDT具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［8］，本文在SDT組也觀察到了鱗癌細(xì)胞有核物質(zhì)凝集、趨胞膜邊緣排列以及凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡特征，提示超聲激活A(yù)TX-70殺傷鱗癌細(xì)胞的過程中也可能存在著細(xì)胞凋亡的模式，這一結(jié)果與使用血卟啉的PDT結(jié)果相似。在形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上，今后如能進(jìn)一步了解作用的分子機(jī)制可能涉及到膜受體介導(dǎo)的凋亡信號調(diào)節(jié)通路［9］，必將會極大地推動PDT和SDT的改進(jìn)和提高，使其更好地造福人類。

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Effect of Sono-photodynamic Combination Therapy on the Ultrastructure of Squamous Cell Carcinoma in Mice

DU Jiangang，LAO Limin
（1.Department of Dermatoloty，the Second Affiliated of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310009，Zhejiang，China；2.Department of Dermatoloty，Shaoxing Central Hospital，Shaoxing 312000，Zhejiang，China）

Objective:To observe the ultrastucture of experimental squamous cell carcinoma in mice after sono-photodynamic combination therapy.Methods:Analogues of a gallium-porphyrin derivative（ATX-70）was used as photosensitizer and sonosensitizer in this study.The squamous cell carcinoma in mice was treated by photodynamic therapy，sonodynamic therapy and sono-photodynamic combination therapy respectively.The changes of ultrastructure of sample preparation for different time were observed by transmission electron microscope.Results:The degree of destruction of treated squamous cell carcinoma cells was enhanced with the increasing of time，which was induced by photo-activated or ultrasound-activated ATX-70.However，the sono-photodynamic combination therapy was more effective.The sites destroyed mainly involved cell membrane，mitochondrion，endoplasmic reticulum and cell nuclei.Furthermore，morphoiogical characters of apoptosis were observed on cancer cells.Conclusion:This study suggested that the sono-photodynamic combination therapy is more effective in terms of its antitumor effect when compared with photodynamic therapy or sonodynamic therapy alone.The killing of tumor cells was ascribed mainly to the damage of ultrastructure，apoptosis wasalso induced during the killing process.

photodynamic therapy；sonodynamic therapy；squamous cell carcinoma/ultrastructure

R454

A

1007-7146（2015）04-0331-04

2014-12-02；

2015-06-12

堵建崗（1973-），男，副主任醫(yī)師，在職研究生，主要從事皮膚腫瘤的診治研究。（電話）13588585466；（電子信箱）djgdd1973@163.com

勞力民，男，教授，碩導(dǎo)，主要從事皮膚腫瘤超微形態(tài)學(xué)研究。（電話）13757128332；（電子信箱）laolimin163@163.com