鈷鉻合金與鈦合金修復材料的細胞相容性研究

嚴濤

鈷鉻合金與鈦合金修復材料的細胞相容性研究

嚴濤

目的 研究2種牙科金屬材料鈷鉻合金、鈦合金浸提液對人牙齦成纖維（HGF）細胞的細胞相容性。方法 以鈷鉻合金、鈦合金的浸提液培養HGF細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養基作為空白對照。采用MTT法在細胞水平評價2種牙科金屬材料的細胞毒性，使用試劑盒檢測細胞中還原型谷胱甘肽（rGSH）的含量，采用ELISA法檢測2種牙科金屬材料浸提液對HGF細胞腫瘤壞死因子（TNF）-α分泌的影響，采用實時PCR（real-time PCR）在基因水平檢測2種牙科金屬材料浸提液對HGF細胞凋亡相關基因caspase-3 mRNA表達的影響。結果 鈷鉻合金組抑制了HGF細胞增殖，與空白對照組差異有統計學意義，鈦合金組促進了HGF細胞增殖。與空白對照相比，鈷鉻合金組抑制了HGF細胞rGSH的產生（P＜0.05），促進了HGF細胞TNF-α的分泌（P＜0.05），而鈦合金對HGF細胞rGSH產生、TNF-α分泌沒有明顯影響；鈷鉻合金組caspase-3的基因表達高于空白對照組（P＜0.05），而鈦合金對caspase-3基因表達無明顯影響。結論 鈷鉻合金對HGF細胞具有一定的細胞毒性，而鈦合金細胞相容性良好。

鉻合金；鈦；谷胱甘肽；腫瘤壞死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；鈷鉻合金；鈦合金；人牙齦成纖維細胞；細胞相容性

過去幾十年間，隨著對金、鈀等貴金屬合金價格管制的放寬，人們開始尋求新的非貴金屬合金［1］。在選擇合金的過程中需要考慮的一個重要因素就是它的生物學性質。近年來，鈷鉻合金［2］及鈦合金因其良好的機械性能在口腔修復領域得到了大量應用。由于口腔內唾液的溶解、細菌活性及溫度等綜合因素的影響，金屬材料處于一個易于生物降解的環境中［3］。金屬離子釋放到口腔后，會接觸毗鄰的細胞及組織，并通過血液流動而分布到全身各處，可能導致細胞毒性、過敏等不良反應。因此對于口腔內金屬材料的生物安全性評價尤為重要。本研究選取人牙齦成纖維（HGF）細胞，觀察2種金屬浸提液的細胞毒性，及對細胞內還原型谷胱甘肽（rGSH）含量及腫瘤壞死因子（TNF）-α分泌的影響，并進一步利用實時PCR（real-time PCR）技術檢測caspase-3基因表達的變化，旨在評價2種口腔修復科常用金屬材料的細胞相容性，為其臨床應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鈷鉻合金、鈦合金購自Bego公司。鈷鉻合金成分：鈷（Co）61%、鉻（Cr）24%、鉬（Mo）7%、鎢（W）4.5%，Si、Fe、Ce各小于2%。鈦合金成分：鈦（Ti）4%，鎳（Ni）62%，Cr 17%。DMEM培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；Ⅰ型膠原酶、MTT購自美國Sigma公司；DMSO購自美國Amerisco公司；逆轉錄試劑盒、SYBRGreen購自TaKaRa公司；rGSH測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒購自吉泰遠成生物科技有限公司；real-time PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 浸提液制備 將鈷鉻合金、鈦合金分別鑄造成直徑6 mm，高3 mm的圓柱體，打磨、拋光后，超聲清洗15 min。用去離子水沖洗數遍后，置于玻璃小瓶中，將不同合金的金屬片于121℃高壓滅菌后，置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液。在37℃、5%CO2條件下連續浸提7 d，將浸提液用0.2 μm過濾器過濾，4℃冰箱保存，備用。

1.3 HGF細胞的原代培養 選取20～24歲青少年因正畸拔除的前磨牙，用PBS（含雙抗）反復沖洗，無菌條件下刮取牙頸部的牙齦組織，剪碎后用2.0×105U/LⅠ型膠原酶37℃消化1 h，800 r/min離心5 min，棄上清，用無血清DMEM培養液懸浮組織，800 r/min離心5 min，棄上清，加適量含10% FBS的DMEM培養液，連同組織塊轉至6孔板，37℃、5% CO2條件下培養。每2～3 d換液1次，取第3～5代細胞用于實驗。

1.4 MTT實驗 將HGF細胞按照1×104/孔的濃度接種于96孔板，每組設6個復孔。待細胞貼壁后，棄去原液，加入2種金屬浸提液，培養24 h后，加入20 μL MTT（5 g/L）作用4 h，然后加入150 μL DMSO溶解結晶，用分光光度儀（Labsystems Dragon Wellscan MK3，Finland）在570 nm和630 nm處測量光密度（OD）值。按OD值計算細胞活力。計算細胞相對增殖R，R=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%，正常培養液組為空白對照組。

1.5 細胞內rGSH含量的測定 HGF細胞經胰酶消化后，調整細胞密度為1×105/孔接種于6孔板中，每孔2 mL，待細胞進入對數生長期時，加入2 mL金屬浸提液，同時設置空白對照組（正常DMEM培養液）。置于5%CO2、37℃培養箱中孵育24 h，PBS洗滌細胞1次，離心收集細胞，吸盡上清，加入細胞沉淀體積3倍量的偏磷酸緩沖液充分混懸，利用液氮和37℃水浴對樣品進行3次快速的凍融，4℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書測定rGSH含量。用Bradford法測定細胞蛋白水平校正細胞內rGSH含量。

1.6 ELISA實驗 將成纖維細胞以1×106/孔接種于6孔板中。24 h后每孔加入2 mL上述金屬浸提液，作用24 h后，收集上清，嚴格按照試劑盒說明書操作測定TNF-α含量，正常培養液組為空白對照組。

1.7 real-time PCR實驗 用real-time PCR方法研究金屬浸提液對HGF細胞caspase-3基因表達的影響。使用2種牙科金屬材料浸提液處理HGF細胞24 h后，使用TRIZOL試劑（Invitrogen，USA）提取總RNA。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa，Japan）將1.0 μg RNA逆轉錄為cDNA，采用real-time PCR試劑（SYBR Premix EX Taq，TaKa-Ra），在Bio-Rad系統（MyiQ2，USA）上進行real-time PCR檢測。以GAPDH為內參照，數據用ΔΔCt方法進行分析，用GAPDH進行標化。正常培養液組為空白對照組。引物序列見表1。

Tab.1 Primers used for real time RT-PCR表1 Real-time PCR實驗中所用的引物

1.8 統計學方法 使用SPSS 11.0軟件進行數據統計分析。3次獨立實驗取得的數據以均數±標準差表示，組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HGF細胞形態觀察 HGF細胞貼壁生長，呈梭形，伸展良好，見圖1。

Fig.1 Microscopic image of human gingival fibroblasts（×10）圖1 人牙齦成纖維細胞鏡下觀察（×10）

2.2 2種合金對HGF細胞增殖率的影響 與空白對照組相比，鈷鉻合金組抑制了HGF細胞的增殖，而鈦合金促進了HGF細胞的增殖，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on proliferation of human gingival fibroblasts表2 鈷鉻合金與鈦合金對HGF細胞增殖率的影響

2.3 2種合金對HGF細胞內rGSH產生、TNF-α分泌及caspase-3基因表達的影響 與空白對照相比，鈷鉻合金組抑制了HGF細胞rGSH的產生（P＜0.05），促進了HGF細胞TNF-α的分泌（P＜0.05），而鈦合金對HGF細胞rGSH產生、TNF-α分泌沒有明顯影響；鈷鉻合金組caspase-3的基因表達高于空白對照組（P＜0.05），而鈦合金對caspase-3基因表達無明顯影響，見表3。

Tab.3 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on rGSH，TNF-α production and caspase-3 mRNA expression of human gingival fibroblasts表32 種合金對HGF細胞rGSH產生、TNF-α分泌及caspase-3基因表達的影響（n=3，±s）

Tab.3 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on rGSH，TNF-α production and caspase-3 mRNA expression of human gingival fibroblasts表32 種合金對HGF細胞rGSH產生、TNF-α分泌及caspase-3基因表達的影響（n=3，±s）

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3 討論

鈷鉻合金具備貴金屬合金與非貴金屬合金的優點，其可用于固定義齒修復，尤其是可摘局部義齒的支架，但鈷鉻合金的生物相容性有待觀察［4］。鈦合金的大量應用是因為其耐腐蝕和良好的物理性能［5］。盡管牙科合金釋放的金屬離子不會造成全身系統性毒性，但合金與組織的緊密接觸會創造一個微環境，例如齦溝和支架區有較高的金屬離子濃度，因此，對于鈷鉻合金與鈦合金的細胞相容性評價是十分必要的。

HGF細胞是人牙齦結締組織和牙周膜中的主要細胞類型，在牙齒的發育、牙周組織的生理病理改變及牙周組織再生等方面具有重要作用［6］。MTT結果顯示，鈷鉻合金浸提液抑制了HGF細胞的增殖，而鈦合金浸提液促進了細胞增殖，這一結果與al-Hiyasat等［7］的研究結果相似，他們發現鈷鉻合金浸提液具有一定的細胞毒性。活性氧（ROS）主要包括羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫，過多的ROS所引起的氧化應激，會導致細胞DNA損傷，正常生理活動下ROS產生量很少，且可以被rGSH清除，rGSH是一種低分子清除劑，可以清除活性中間體或直接淬滅自由基等［8］。rGSH的產生量可以間接衡量ROS的產生量。本研究發現，與空白對照組相比，鈷鉻合金組的rGSH量有所降低，表明鈷鉻合金誘導HSF細胞產生了較為顯著的ROS，引起了氧化應激，而鈦合金組卻沒有導致rGSH的變化，表明其沒有引起細胞ROS的變化，細胞保持了正常的功能狀態。TNF-α是重要的細胞因子，在炎癥反應和細胞免疫應答中發揮著重要的作用，同時，其還可介導細胞的凋亡［9］。與空白對照組相比，鈷鉻合金引起了TNF-α的顯著分泌，表明鈷鉻合金引起了較為顯著的免疫反應，而鈦合金卻沒有引起TNF-α的增加。上述結果表明，鈷鉻合金具有一定的細胞毒性，進一步在基因水平研究發現鈷鉻合金促進了caspase-3的基因表達，而鈦合金對其表達沒有明顯影響。Caspase-3是caspases級聯反應中的關鍵效應分子，caspase-3被激活后依次裂解細胞內其他蛋白底物，最終會觸發細胞凋亡［10］。上述結果顯示，鈷鉻合金的細胞毒性可能是由于其激活了caspase-3基因的表達進而誘導了細胞凋亡所引起。鈷鉻合金具有一定的細胞毒性，而鈦合金細胞相容性較好。

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（2014-07-23收稿 2015-01-09修回）

（本文編輯 李國琪）

The study of cytocompatibility of Co-Cr alloy and Ti alloy

YAN Tao
Department of Stomatology，Weifang People's Hospital，Shandong 261041，China

Objective To investigate the cytocompatibility of the liching liquids of Co-Cr alloy and Ti alloy on human gingival fibroblasts（HGF）.Methods The HGF were treated in vitro with leaching liquids of Co-Cr alloy and Ti alloy，respectively.The DMEM cell medium containing 10%fetal bovine serum was served as a negative control.The viability of HGF treated by two dental alloys were evaluated by means of MTT，and the contents of intracellular reduced glutathione （rGSH）were assayed by kits.The tumor necrosis factor-α（TNF-α）contents were determined in the culture supernatant by ELISA in two groups.The effects of these alloys on the expression of caspase-3 were examined by real time-PCR method.Results Compared with the control group，HGF treated with Co-Cr alloy leaching liquids showed a lower viability（P＜0.05），while Ti alloy leaching liquid promoted the proliferation of HGF.In Co-Cr alloy group，the rGSH content was significantly decreased（P＜0.05），while TNF-α content was significantly increased（P＜0.05）compared with control group.There were no significant differences in rGSH and TNF-α contents between the Ti alloy group and control group（P＞0.05）.The expression of caspase-3 was significantly higher in Co-Cr alloy group than that of control group（P＜0.05），while there was no significant difference in the expression of caspase-3 between Ti alloy group and control group.Conclusion Results suggest that Co-Cr alloy possesses cytotoxicity，while there is better cell compatibility for Ti alloy.

Chromium alloys；Titanium；glutathione；tumor necrosis factor-alpha；caspase 3；Co-Cr alloy；Ti alloy；human gingival fibroblast；cytocompatibility

R783.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.021

山東省濰坊市人民醫院牙科（郵編261041）

嚴濤（1971），男，主管技師，學士學位，主要從事口腔修復研究