磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣復合物與多聚磷酸鈉對脫礦牙本質仿生再礦化的影響

苗瑞婧，張旭，孫迎春，高平

應用研究

磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣復合物與多聚磷酸鈉對脫礦牙本質仿生再礦化的影響

苗瑞婧，張旭，孫迎春，高平△

目的 探討磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣（P-chi/ACP）與多聚磷酸鈉（TPP）對脫礦牙本質體外仿生再礦化的影響，為深齲再礦化治療提供思路。方法 將32顆中度磨耗的離體磨牙制成大小相同的完全脫礦牙本質片32個，其中2個樣品用于透射電鏡表征，另30個分成2組：P-chi/ACP+TPP組（n=15）經TPP預處理后，固定在放置有P-chi/ACP的體外模型上；P-chi/ACP組（n=15）不經過TPP處理。所有樣品根據是否與P-chi/ACP接觸分為實驗側與對照側。處理1周后，進行顯微計算機斷層掃描定量分析密度變化、透射電子顯微鏡定性分析微觀形態變化。結果 顯微計算機斷層掃描結果顯示P-chi/ACP+TPP組的實驗側灰度值高于對照側（125.42±12.16 vs 96.96±10.56，t= 7.124，P＜0.01），P-chi/ACP組中的實驗側灰度值高于對照側（119.39±8.64 vs 105.27±9.42，t=5.329，P＜0.01）。透射電子顯微鏡顯示P-chi/ACP+TPP組有纖維內橫紋樣結構出現，提示脫礦牙本質片實現了其主要成分Ⅰ型膠原的分級化纖維內礦化；P-chi/ACP組未見橫紋樣結構。結論 單獨利用P-chi/ACP能夠提高脫礦牙本質的密度，但共同利用TPP與P-chi/ACP復合物才能實現完全脫礦牙本質的仿生再礦化。

牙本質；仿生學；磷酸化殼聚糖；多聚磷酸鈉；再礦化

微創牙科（minimally invasive dentistry，MID）在治療深齲時往往進行間接蓋髓以促進軟化牙本質的再礦化［1］。傳統的氟化物再礦化方法必須依賴殘余晶體，因此對于脫礦程度較大的牙本質，再礦化效果不夠理想［2］。研究表明，利用聚丙烯酸［3］和多聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）［4］能夠使膠原纖維和部分脫礦牙本質再礦化，但目前尚少有研究利用仿生材料對完全脫礦的牙本質進行仿生再礦化。本研究利用具有良好生物相容性的磷酸化殼聚糖（phosphorylated chitosan，P-chi），研究新型仿生礦化材料對不含殘余晶體的完全脫礦牙本質的再礦化效果，并利用體外模型模擬深齲結構，探索深齲底部軟化牙本質的仿生再礦化治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料 因松動拔出的人中度磨耗離體磨牙共32顆（我院口腔頜面外科）。乙二胺四乙酸（EDTA）、殼聚糖、TPP、CaCl2·2H2O、Na2HPO4均購自上海生工生物工程股份有限公司。傅里葉變換紅外光譜儀（MAGNA-560，Nicolet，美國）、顯微計算機斷層掃描儀（1174-v2，Skyscane，比利時）、透射電子顯微鏡（JEM-2100F，JEOL，日本）、蠕動泵（BT/101S，雷弗，中國）。

1.2 方法

1.2.1 脫礦牙本質片的制備 將32顆磨牙制成直徑為1 cm、厚度為1 mm的牙本質片。在37℃恒溫搖床中，用0.5 mol/L EDTA溶液處理2周做成脫礦牙本質片。選取其中2個樣品進行透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）表征。

1.2.2 磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣復合物（P-chi/ACP）的制備 根據文獻［5］中的方法制備P-chi，將2.0 g殼聚糖與適量P2O5粉末加入20 mL甲基磷酸中，在0～5℃恒溫環境下攪拌3 h后，在-20℃冰箱中靜置24 h，取出后用甲醇沉淀，并通過離心收集，丙醇洗凈，離心3個循環后，通風櫥下風干，得到1.0～1.3 g P-chi。按照60 mmol/L Na2HPO4、50 g/L P-chi、100 mmol/L CaCl2·2H2O的先后順序和濃度配制溶液，攪拌至完全溶解。將孔徑1 cm的多孔板切割為孔高1 mm的模具，利用冷凍干燥技術制備出直徑1 cm，厚度1 mm的圓盤狀P-chi/ACP復合物。衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀（attenuated total internal reflectance，ATR-FTIR）、掃描電子顯微鏡及TEM對P-chi/ACP進行表征。

1.2.3 樣品分組 將余下30個牙本質片均分為2組，A組：P-chi/ACP+TPP組；B組：P-chi/ACP組。A組樣品在脫礦處理后，浸泡于25 g/L TPP（pH=9.7）溶液中24 h。B組樣品不進行25 g/L TPP處理。ATR-FTIR分別對2組樣品進行表征。

1.2.4 體外再礦化模型的構建 建立體外再礦化模型，模擬深齲墊底環境，用離心管和滴管頂部制成雙層結構，分別模擬窩洞干燥的環境與牙髓腔的體液循環環境。采用蠟固定P-chi/ACP與牙本質片。塑料隔離帽中央制備1個直徑為2 mm的圓孔，模擬牙本質小管結構，模擬體液通過蠕動泵以10 mL/min的速度在下層循環，上層干燥，見圖1。采用劉燕等［3］的方法進行模擬體液配制。實驗進行1周之后取出樣品。

Fig.1 In vitro model of remineralization圖1 體外深齲模型示意圖

1.2.5 微型計算機斷層掃描（Micro-computed tomography，μCT）檢測 經過1周的實驗處理后將樣品取出，用μCT對樣品進行非破壞性的三維掃描。利用CT-An軟件（Skyscane）將牙本質片的掃描圖像進行三維重建、疊加后，分別采集每個樣品對照側與實驗側的灰度平均值。

1.2.6 TEM檢測 P-chi/ACP支架、2個脫礦牙本質片與實驗處理后的30個牙本質片，經過固定、脫水、包埋和修塊后，切出100 nm厚的透射電鏡制件，于TEM下觀察超微結構，以判斷是否實現牙本質膠原纖維內分級再礦化。

1.3 統計學方法 數據以均數±標準差表示，采用SPSS17.0統計軟件分析，對數據進行正態性檢驗與方差齊性檢驗，數據呈正態分布，方差齊性，比較采用配對t檢驗，以雙側P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牙本質片的ATR-FTIR檢測結果 ATR-FTIR檢測EDTA脫礦后的牙本質片，出現Ⅰ型膠原的特征峰，且未出現磷酸鈣晶體的特征峰，見圖2。牙本質片經過25 g/L TPP預處理后，出現磷酸特征峰，見圖3。提示牙本質片經過EDTA處理后為完全脫礦牙本質，經過25 g/L TPP處理后完全脫礦牙本質片被磷酸化。

Fig.2 ATR-FTIR of dentin demineralized by EDTA圖2 牙本質片經EDTA脫礦處理后的ATR-FTIR結果

2.2 P-chi/ACP的ATR-FTIR檢測結果與TEM檢測結果 ATR-FTIR顯示P-chi/ACP具有PO的特征性波峰，且無磷酸鈣晶體的尖銳峰，見圖4，提示P-chi/ACP中無磷酸鈣晶體。TEM圖像顯示P-chi/ ACP的超微結構為納米球形顆粒，見圖5，提示Ca2+與PO離子結合為非晶相的無定形磷酸鈣顆粒。

Fig.3 ATR-FTIR of demineralized dentin treated by 25g/L TPP圖3 脫礦牙本質片經25g/L TPP處理后的ATR-FTIR結果

Fig.4 ATR-FTIR of P-chi/ACP圖4 P-chi/ACP復合物的ATR-FTIR結果

2.3 牙本質片μCT檢測結果 2組牙本質片實驗側的灰度值均高于對照側，見表1。分別從2組中選出1張典型的三維重構圖像，以分析灰度值增高的范圍及分布特征，見圖6。用Image J軟件對圖6中灰度值隨深度的變化趨勢進行繪圖，結果示2組中實驗側的灰度值均高于對照側，灰度值增高區域的深度達到距牙本質片上表面0.7 mm以上，且隨著深度增加，灰度值有減小趨勢，見圖7。

Tab.1 Comparison of grey values of experimental and control sides between two groups表1 2組牙本質片實驗側與對照側的灰度值比較

Fig.6 Three-dimension superimposed image of dentin disks圖6 牙本質片縱截面三維重構疊加圖像

Fig.7 Image J analysis of reconstructed longitudinal sections of dentin disks圖7 牙本質片縱截面三維重構圖像Image J分析圖

2.4 EDTA處理后的牙本質片TEM檢測結果 EDTA處理后的牙本質片主要結構為膨松的膠原纖維，見圖8。A組牙本質片經過1周再礦化處理后牙本質膠原纖維排列致密，膠原纖維內具有橫紋樣結構，提示牙本質片實現了其主要成分Ⅰ型膠原的分級化纖維內礦化，見圖9。B組牙本質片經過1周再礦化處理后牙本質膠原纖維塌陷，條帶不清晰，纖維內部僅觀察到窄細條紋，未出現纖維內橫紋樣結構，提示未實現Ⅰ型膠原的分級化纖維內礦化，見圖10。

3 討論

本研究ATR-FTIR結果顯示，經脫礦處理后牙本質的主要成分為Ⅰ型膠原，說明牙本質片已被完全脫礦，不含無機成分及殘余晶體。在掃描參數一致的條件下，μCT掃描后的三維重建圖像中，灰度值與實際礦物質密度為線性關系，灰度值越高代表礦物質密度越高［6］。本研究μCT掃描結果顯示，2組實驗側灰度值均高于對照側，提示利用P-chi/ACP可以實現脫礦牙本質片礦物質密度的增加。由典型的三維重建圖像分析中可見，2組樣品礦物質密度增高區域的深度可達到0.7 mm以上，說明材料可以透過表面滲入到牙本質片的深層，具有應用于深齲底部軟化牙本質再礦化治療的潛力。

TEM圖像中顯示P-chi/ACP微觀結構為納米球形顆粒。P-chi是一種多聚電解質，能夠將Ca2+與PO離子包裹形成無定形的納米磷酸鈣亞穩定結構，成為礦化提供結晶來源。研究表明，牙本質膠原帶正電荷，具有周期性的結構，有空隙區和重疊區，能通過靜電作用吸引帶負電的ACP納米球，ACP進一步成核、生長，使牙本質膠原實現再礦化［7］。晶體結晶理論是指導膠原仿生礦化方法研究的重要基礎理論之一［8］，非經典的結晶理論中，多聚電解質將離子穩定為無定形的初始粒子。本研究中的P-chi材料具有將Ca2+與PO離子穩定為無定形磷酸鈣的粒子，是牙本質基質蛋白 1（dentin matrix protein，DMP1）的仿生物，與Dai等［9］利用聚丙烯酸（PAA）將Ca2+與PO組裝成了無定形納米磷酸鈣，從而礦化膠原組織的研究結果一致。

2 組樣品經處理后的礦物質密度均有所增加，微觀結構也有所差異。TEM圖像中，A組出現纖維內橫紋樣結構，B組膠原纖維塌陷，說明A組樣品的超微結構更接近于自然礦化組織，與Tay等［10］的研究結果一致。牙本質的再礦化不僅在于密度的增加，更重要的是要實現接近自然礦化組織的分級結構，從而提高其機械性能，因此A組較B組更好地實現了仿生再礦化。

推測在TPP的作用下，2組礦化的機制不同。A組樣品在TPP堿性溶液處理的條件下，膠原表面的氨基酸缺乏正電荷，與帶負電荷的ACP粒子不能主動相互吸引。A組中完全脫礦的牙本質片在經過TPP處理后，ATR-FTIR結果顯示出現PO3/P-O-P的特征峰，說明牙本質膠原發生了磷酸化。研究表明，TPP能夠與膠原分子中空隙區的氨基酸離子交聯，有利于進一步螯合ACP納米球中的鈣離子，最終形成纖維內的分級再礦化［11］。未經TPP處理的膠原纖維中，隨著ACP納米球的不斷沉積，靜電勢能逐漸縮小，在空隙區和重疊區的每個礦化帶微晶分布逐漸均勻，形成的分級結構不明顯［9］。

以往研究多采用部分脫礦的牙本質、Ⅰ型膠原凍干粉，本研究樣品來自人離體磨牙，更接近于向臨床醫學的轉化。深齲墊底再礦化的體外模型的建立，可應用于更多的牙本質再礦化體外研究與深齲治療的實驗研究。本研究中采用的P-chi生物相容性較好，已廣泛使用于醫藥研究，較以往使用較多的PAA具有更良好的生物相容性。雖然P-chi/ACP復合物尚不能直接應用于臨床，但本實驗已經證實完全脫礦的牙本質膠原能夠在P-chi/ACP支架的作用下實現礦物質含量的增加和纖維內的分級再礦化，但其缺點為不易保持形態穩定，今后的研究可以致力于提高材料的親水性及耐久性，并能建立ACP納米顆粒的緩釋系統。

（圖5、8～10見插頁）

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（2014-11-20收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 閆娟）

In vitro biomimetic remineralization of dentin collagen by phosphorylated chitosan/amorphous calcium phosphate compound and tripolyphosphate

MIAO Ruijing，ZHANG Xu，SUN Yingchun，GAO Ping△
Stomatological Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：Gaoping@tmu.edu.cn

Objective To investigate the remineralizing therapy of deep caries and in vitro biomimetic remineralization of demineralized dentin by phosphorylated chitosan/amorphous calcium phosphate compound（P-chi/ACP）and tripolyphosphate（TPP）.Methods Thirty-two extracted human molars were cut and completely demineralized.Two samples were used to show the characteristics by transmission electron microscopy（TEM）.The other 30 samples were divided into two groups: fifteen samples were treated by P-chi/ACP and TPP（P-chi/ACP+TPP group），the other fifteen samples were not treated by TPP（P-chi/ACP group）.All of the samples were distinguished into experimental side and control side，and then they were set on the in vitro model for 1 week.Micro-computed tomography（μCT）and TEM were used to assess the effects of remineralization.Results μCT detection revealed that the mineral density were higher in the experimental sides（125.42±12.16 and 119.39±8.64）than that of control sides（96.96±10.56 and 105.27±9.42）in both groups（P＜0.01）.TEM figures showed that hierarchical intrafibrillar remineralization was realized in samples of P-chi/ACP+TPP group，while trace amounts of hierarchical remineralization was detected in P-chi/ACP group.Conclusion Fully demineralized dentin appears to have the potential to be remineralized with the application of P-chi/ACP.The ultrastructure of samples is better in P-chi/ACP+TPP group than that of P-chi/ACP group.

dentin；bionics；phosphorylated chitosan；sodium tripolyphosphate；remineralization

R781.1；R318.08

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.019

國家自然科學基金青年項目（81200817）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃青年項目（12JCQNJC09200）

天津醫科大學口腔醫院（郵編300070）

苗瑞婧（1989），女，碩士在讀，主要從事口腔材料研究

△E-mail：Gaoping@tmu.edu.cn