彌漫型肝細胞癌的克隆起源研究

張魯洲，王政祿，王玉亮，鄭虹?

臨床研究

彌漫型肝細胞癌的克隆起源研究

張魯洲1，王政祿2，3，王玉亮2，4，鄭虹2，3?

目的 探究彌漫型肝細胞癌（D-HCC）的腫瘤克隆起源方式及其行肝移植治療的預后。方法 選取2004 年8月—2012年11月天津市第一中心醫院肝移植治療的14例D-HCC患者，收集患者一般資料及術后無瘤生存資料。選取12個高頻肝癌微衛星雜合性缺失（LOH）位點，通過聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性（PCR-SSCP）評估D-HCC的腫瘤克隆起源方式。結果 14例D-HCC患者中，有11例單中心克隆起源（IM），3例單中心伴多中心克隆起源（IM+MO）。術后無瘤生存時間為4.5～37.4個月，無瘤生存中位時間為8.7個月。結論 D-HCC的腫瘤克隆起源方式以IM為主，肝移植可能是較為有效的治療手段。

癌，肝細胞；雜合子丟失；肝移植；彌漫型肝細胞癌；克隆起源

彌漫型肝細胞癌（diffuse hepatocellular carcinoma，D-HCC）是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中最罕見的類型之一［1］。其發病常基于中重度肝硬化，臨床上通過影像學表現很難與肝硬化區分。由于D-HCC發病率較低、缺乏相對有效的治療手段，且其癌灶彌漫于全肝，故無法進行手術切除，而單純的放化療效果并不理想，預后很差。一直以來對D-HCC的研究較多結節肝細胞癌少。目前，國內外針對D-HCC的研究多傾向于對該病的診斷［2-4］，而對該病中癌灶的生物學特性方面的研究罕有涉及。筆者對病肝通過肝癌微衛星雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）探討癌組織克隆起源及D-HCC的生物學特性，為移植治療D-HCC的可行性提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004年8月—2012年11月天津市第一中心醫院收治的原位肝移植治療的14例D-HCC患者資料。根據WHO對D-HCC的定義，選取了術后經病理證實腫瘤結節直徑0.1～1.5 cm，且均勻分布于全肝的病例。本研究通過了醫院倫理委員會審批。患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床數據收集 （1）記錄性別、年齡、肝病背景及術前血清甲胎蛋白（AFP）水平。（2）從每個切除肝臟的4個不同位置分別獲得腫瘤組織，且每一部位相距＞5 cm。所有標本常規方法進行福爾馬林固定和石蠟包埋，4 μm石蠟切片，常規HE染色。由2位病理學專業醫生共同診斷作為最后診斷結果。

1.2.2 DNA提取和PCR 對石蠟包埋標本進行10 μm厚度、5～10張數量的切片，常規二甲苯-梯度乙醇方法脫蠟。在顯微切割顯微鏡下通過顯微切割獲得癌組織和非癌組織。提取癌及非癌組織的DNA，提取方法依照試劑盒提供的流程進行，試劑盒購自成都福際生物技術有限公司。參考文獻［5-8］，選取12個微衛星高頻LOH位點。根據位點信息由寶生物（大連）公司合成相關引物。本研究中使用12個微衛星引物，見表1。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR產物10 μL加入2 μL上樣緩沖液［6×DNA-Loading Buffer，由寶生物（大連）公司生產］，放入95℃恒溫水浴鍋10 min變性，然后迅速放置在冰上10～15 min，將處理好的樣品加入到已經制備好的8%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在100 V下電泳2 h，對凝膠進行銀染［7］顯色后，判定LOH。PCR反應與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行至少2次，以確認LOH判定的準確性。

Tab.1 Characters of 12 microsatellite markers表1 微衛星引物詳情

1.2.4 LOH分析 在信息性病例中（根據2個等位基因的4條單鏈在變性聚丙烯酰胺不同的構象，通過電泳進行分離，如果條帶≥3為雜合子），與正常組織相比，腫瘤的DNA擴增產物條帶消失或密度減少50%及以上的判定為LOH。相反，如腫瘤的DNA擴增產物條帶密度無減少或減少＜50%以上，則為雜合性保留。參考以往對LOH用于肝癌克隆起源的研究，其判斷標準［9］：如2個腫瘤之間不同位點的LOH結果≥30%不同，則認為其多克隆起源，即多中心發生（multicentric occurrence，MO）；如2個腫瘤之間LOH結果相同或均為雜合性保留，則認為是單克隆起源，即單中心發生（introhepatic metastasis，IM）；而＜30%不同被認為是無法判斷克隆起源。比較每例D-HCC患者的不同部位癌組織在不同的微衛星位點LOH的差異，作為判斷肝細胞癌不同克隆起源的分子生物學依據。

1.2.5 隨訪 以術后3年內D-HCC患者腫瘤有無復發為隨訪終點，收集14例患者的術后無瘤生存時間資料，繪制患者Kaplan-Meier生存曲線。

1.3 統計學方法 采用SPSS 15.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示。

2 結果

2.1 患者一般特征 14例患者中男13例，女1例，年齡47～67歲，平均（54±6）歲。伴有乙肝肝硬化9例，丙肝肝硬化3例，乙、丙肝肝硬化2例。9例術前AFP水平＞20 μg/L，其中6例＞500 μg/L。

2.2 LOH的發生頻率及克隆起源類型判定 所有D-HCC在1個或幾個位點均發生了LOH。統計位于 1p36.3、1p36.1、4q26、8p23、13q14.3、16q12.1、16q24.1、16q21、17p13.3、17p13.1的肝癌LOH的高頻位點D1S243、D1S507、D4S402、D4S406、D8S277、D8S520、D13S268、D16S419、D16S505、D16S514、D17S831、D17S938發生LOH的頻率分別為21.4% （3/14）、35.7%（5/14）、28.6%（4/14）、21.4%（3/14）、28.6%（4/14）、28.6%（4/14）、21.4%（3/14）、28.6% （4/14）、14.3%（2/14）、35.7%（5/14）、35.7%（5/14）和21.4%（3/14），有代表性的結果見圖1。LOH在12個位點的發生頻率見表2。本研究中，11例癌灶克隆起源為IM，3例為IM和MO同時存在，結果顯示盡管有3例患者的癌灶克隆起源為2種，但這并不影響筆者得出D-HCC中存在廣泛轉移這一結論。

Fig.1 Decision of LOH in D-HCC圖1 D-HCC雜合性缺失的判定

Tab.2 Frequency of LOH at 12 microsatellite loci in D-HCC表2 12個肝癌微衛星位點發生雜合性缺失的統計

2.3 治療及隨訪情況 14例患者手術方式均為原位肝移植術，且術后均采用“他克莫司+塞尼哌+霉酚酸酯+甲基強的松龍”的免疫抑制方案。14例無瘤生存時間為4.5～37.4個月，中位時間為8.7個月，其中3例無瘤生存時間超過24個月。患者的Kaplan-Meier生存曲線，見圖2。

Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of D-HCC patients圖2 D-HCC患者的生存曲線

3 討論

3.1 D-HCC的特點 D-HCC常伴有顯著的肝硬化，因其腫瘤大小與質地較普通的肝硬化結節較難區分，臨床上，如影像學醫師的經驗不夠豐富，有時會將其漏診而單純診斷為肝硬化。有研究總結D-HCC的特點，主要為全肝彌漫結節，是D-HCC的特征性表現，主要特點為：腫瘤呈廣泛性粟粒狀、結節狀分布，早期腫瘤病灶較小，晚期多呈結節狀；結節可大小不等，但大多局限于0.1～2.0 cm，布滿整個肝臟；其次表現為肝腫大，為D-HCC的較特征性表現，由于此型肝癌多伴有肝硬化，因此肝臟在早期常常表現為輪廓飽滿，呈整體普遍性增大［2，10］。本組14例患者中，經術后病理證實腫瘤結節直徑0.1～1.5 cm；11例患者的病肝較正常肝臟體積增大，有3例顯示肝臟體積縮小，這3例同時發現其肝硬化程度為重度，此時肝臟體積縮小可能與肝硬化的嚴重程度有關。

3.2 D-HCC的克隆起源 本組所有患者瘤灶均發現了IM，其中3例伴有MO，證實了D-HCC存在廣泛的肝內腫瘤轉移，這可能與D-HCC的發生機制有關，也有可能與D-HCC的疾病進展有關。本研究顯示廣泛的肝內轉移是D-HCC的最大特征，提示D-HCC的預后很差。此外，筆者發現部分患者的術前AFP水平較高，這一現象提示臨床醫師應注意肝硬化伴血清AFP高值的患者，在影像學未發現明顯腫瘤時，需要重點與D-HCC相鑒別。

3.3 D-HCC的治療 D-HCC雖較少見，但其預后極差，目前的治療手段主要有放、化療及支持治療。因腫瘤彌漫于整個肝臟，故無法行切除術，只能進行姑息性治療。有研究通過手術或介入的方法治療D-HCC，但幾乎沒有令人滿意的效果［2，10-11］。本組患者移植術后隨訪發現，有3例患者的預后較好。鑒于此，筆者認為肝移植手術可能是有效的治療手段，但由于病例相對較少，因此需要在今后的研究中進一步論證。D-HCC目前尚無統一的治療手段且預后較差，因此尋求有效的治療手段對于D-HCC患者有重大意義，而探索D-HCC發生的機制，則有助于為臨床治療提供一定的理論參考依據。

目前，對于D-HCC的診斷，涉及到具體腫瘤的大小及個數的標準尚未明確，而在原發性肝細胞癌中，常見的多結節肝細胞癌的診斷也沒有對腫瘤的個數在上限上做出明確標準。筆者認為，多結節肝細胞癌和D-HCC的診斷在腫瘤數目上應該有一個明確的分界，確定這個分界或許可以對D-HCC有更加深刻的認識。總之，D-HCC由于其發病率較低，因此診斷相對困難，且缺乏有效統一的治療手段，預后較差，在今后的研究中需要對其發病機制、診斷與治療作更加深入的探討。

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（2014-10-20收稿 2014-12-29修回）

（本文編輯 李鵬）

The clonal origin of diffuse hepatocellular carcinoma

ZHANG Luzhou1，WANG Zhenglu2，3，WANG Yuliang2，4，ZHENG Hong2，3?
1 First Central Clinical Institute of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China；2 Organ Transplant Center，Tianjin First Central Hospital；3 Key Laboratory of Organ Transplantation of Tianjin；4 Key Lab for Critical Care Medicine of the Ministry of Health
△Corresponding Author E-mail:zhenghongxy@163.com

Objective To determine the tumor clonal origin of diffuse hepatocellular carcinoma（D-HCC）and clinical outcome after liver transplantation.Methods Fourteen D-HCC patients who underwent liver transplantation in the Tianjin First Central Hospital between August 2004 to November 2012 were evaluated retrospectively.Their clinical characteristics and data of disease-free survival postoperatively were gathered.Twelve loss of heterozygosity sites（LOH）on high frequency microsatellite were selected.The tumor clonal origin of D-HCC was assessed by the means of PCR-SSCP.Results Of 14 D-HCC patients，intrahepatic metastasis（IM）occurred in 11 cases（11/14），and IM with multicentric occurrence（MO）occurred in 3 cases（3/14）.The disease-free survival time was 4.5 to 37.4 months，and the median time was 8.7 months.Conclusion The most frequent tumor clonal origin of D-HCC was IM.Liver transplantation may be the effective treatment for D-HCC.

carcinoma，hepatocellular；loss of heterozygosity；liver transplantation；diffuse hepatocellular carcinoma；clonal origin

R735.7

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.013

國家高技術研究發展計劃（863）項目（2012AA021001）；國家自然科學基金面上資助項目（81470982）；天津市衛生行業重點攻關項目（13KG103）；天津市衛生局科技基金項目（2014KZ028）

1天津醫科大學一中心臨床學院（郵編300192）；2天津市第一中心醫院器官移植中心；3天津市器官移植重點實驗室；4衛生部危重病急救醫學重點實驗室

張魯洲（1989），男，碩士在讀，主要從事肝腫瘤研究

?E-mail：zhenghongxy@163.com