PPARγ對大鼠心肌缺血/再灌注后惡性心律失常的影響

何學恕，莫新玲，陳華，謝婷

PPARγ對大鼠心肌缺血/再灌注后惡性心律失常的影響

何學恕，莫新玲△，陳華，謝婷

目的 探討大鼠心肌過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ對缺血/再灌注（I/R）后惡性心律失常的影響。方法 24只SD大鼠隨機分為4組：假手術組（Sham組），缺血/再灌注組（I/R組），羅格列酮+缺血/再灌注組（ROS組），PPARγ抑制劑GW9662+缺血/再灌注組（GW組），每組6只。采用冠狀動脈左前降支結扎法制造I/R動物模型，缺血30 min，再灌注2 h。全程肢體Ⅱ導聯心電圖觀察各組惡性心律失常發生次數并記錄校正QT間期（QTc）的變化，RT-PCR檢測PPARγ mRNA表達。結果 ROS組發生5例惡性心律失常，I/R組2例，GW組1例，Sham組0例。ROS組的QTc間期在再灌注期較其他3組延長（均P＜0.05），與I/R組和ROS組相比，GW組的QTc間期在缺血30 min及再灌注過程中縮短（均P＜0.05）。與Sham組相比，其他3組PPAR-γ mRNA表達明顯升高（均P＜0.05），ROS組PPARγ mRNA表達水平最高，GW組較I/R組和ROS組表達下調（均P＜0.05）。結論 PPARγ過表達可能導致心肌I/R惡性心律失常的發生。

PPARγ；心肌；再灌注損傷；心律失常；羅格列酮

心肌缺血/再灌注（I/R）損傷是指心肌在缺血基礎上恢復血供后，結構功能損傷及代謝障礙加重的現象，再灌注心律失常是其常見并發癥之一［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ是一種依賴配體激活的轉錄因子，其在心肌的表達量是血管壁的5倍［2］。噻唑烷二酮類藥物是PPARγ合成配體，研究顯示其對缺血心肌有保護作用［3-4］。目前關于心肌PPARγ過表達對缺血/再灌注惡性心律失常的影響如何報道較少。本研究擬通過觀察大鼠心肌組織PPARγ表達的變化對缺血/再灌注心律失常的影響，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 羅格列酮及PPARγ抑制劑GW9662、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，超純RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR反應試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，DNA Marker購自杭州碧云天，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。BL-420F生物功能實驗系統購自成都泰盟科技公司，電腦動物呼吸機購自江西特力公司。

1.2 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠24只，體質量235～255 g，購自廣西醫科大學動物實驗中心。按隨機數字表法分為4組：Sham組（開胸后冠脈左前降支只穿線，不結扎）；I/R組（結扎冠脈左前降支缺血30 min，再灌注120 min）；羅格列酮+缺血/再灌注（ROS）組（術前腹腔注射羅格列酮6 mg/kg，以后操作同I/R組）；GW9662+缺血/再灌注（GW）組（術前GW9662腹腔注射4 mg/kg，以后操作同I/R組）。每組6只。

1.3 建模 術前大鼠經10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，BL-420F生物功能實驗系統心電監測。氣管切開插管，人工呼吸機輔助通氣，頻率62次/min，吸呼比1.5∶1。胸部去毛消毒后開胸，以6號帶線細針在冠狀動脈根部下1～2 mm、肺動脈和左心耳之間穿過，中間墊一硬質海綿條，止血鉗夾緊胸壁創口，觀察心電圖變化；心電圖ST段抬高判斷為結扎成功。30 min后松止血鉗，拔出硬質海綿條，再灌注2 h。結束后迅速剪下心臟，在心室前壁相同位置留取心肌組織液氮冷凍。

1.4 心電圖觀察 記錄各組缺血/再灌后出現惡性心律失常（室性心動過速、室顫）的例數，比較各組發生率。采用Bazett公式計算心率校正QT間期（QTc），QTc=QT/（RR）1/2，以P-R間期水平為基線，從QRS起點與T波終點之間距離為QT間期，每個時間點測6個波形，取平均值，分別觀察術前開始時，缺血15 min、30 min，再灌注拆線1 h、2 h時QTc間期變化。

1.5 RT-PCR檢測PPARγ mRNA表達 取各組大鼠心肌組織，提取總RNA并測定濃度。取5 μg RNA逆轉錄為cDNA后行PCR反應。引物序列如下：PPARγ上游 5′-TGGACCTCTCTGTGATGG-3′，下游5′-CGCACTTTGGTATTCT TG-3′，產物長度173 bp；內參GAPDH上游5′-TACCCACGGCAAGTTCAACG-3′，下游5′-CACCAGCATCACCCCATTT G-3′，產物長度122 bp。反應條件：94℃5 min；94℃30 s，54℃45 s，30個循環；72℃5 min。4組樣品同時擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描分析各擴增帶吸光度值，以目的基因與GAPDH吸光度比值計算相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件分析，計量資料以±s表示，總體變化趨勢比較采用析因方差分析，組內不同時間點比較、同一時間點不同組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖的變化 Sham組無惡性心律失常發生，I/R組出現2例，GW組1例，ROS組5例。同組大鼠QTc間期在5個時間點的變化趨勢不全相同（F=45.226，P＜0.01），同一時間點4組大鼠間不全相同（F=45.594，P＜0.01），時間與處理因素有交互作用（F=24.916，P＜0.01），即4組大鼠心電圖QTc間期在5個時間點的變化趨勢不全相同。I/R組與ROS組大鼠QTc間期在缺血30 min、再灌注1 h、再灌注2 h時均高于Sham組，GW組大鼠QTc間期在再灌注期均低于ROS組和I/R組（均P＜0.05）；4組間大鼠QTc間期在術前差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of QTc interval of ECG between four groups表1 各組大鼠心電圖QTc間期的比較（ms，±s）

Tab.1 Comparison of QTc interval of ECG between four groups表1 各組大鼠心電圖QTc間期的比較（ms，±s）

＊＊P＜0.01；組間比較：A與Sham組比較，B與I/R組比較，C與ROS組比較，P＜0.05；組內比較：a與術前比較，b與缺血15 min比較，c與缺血30 min比較，P＜0.05；ROS組再灌注1 h時n=5，2 h時n=4，其余時間點n=6，其余3組各時間點n=6。

組別Sham組I/R組ROS組GW組F術前83.83±3.25 82.33±2.88 83.00±3.69 82.67±3.93 0.208缺血15 min 87.50±3.08 97.67±3.33a69.83±4.22Ba90.00±2.28BCa76.350＊＊缺血30 min 86.33±6.31 103.17±10.17Aa111.17±5.31Aa93.83±2.79BCa15.716＊＊組別Sham組I/R組ROS組GW組F再灌注1 h 84.33±2.66 94.67±5.24Aac102.60±4.62ABabc77.50±5.24BCb32.687＊＊再灌注2 h 84.83±2.40 101.00±3.85Aa106.75±4.57ABab84.17±3.43BCb53.700＊＊F 0.947 12.158＊＊86.534＊＊9.333＊＊

2.2 各組PPARγ mRNA表達比較 各組PPARγ mRNA相對表達量分別為Sham組0.155±0.047，I/R 組0.485±0.048，ROS組0.672±0.064，GW組0.293± 0.046，4組間表達差異具有統計學意義（F=104.181，P＜0.05）。與Sham組比較，其他3組PPARγ mRNA表達上調（均P＜0.05）。ROS組PPARγ mRNA表達量明顯高于其他3組，GW組較I/R組和ROS組PPARγ mRNA表達下調（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Expressions of PPARγ mRNA in four groups圖1 各組PPARγ mRNA表達水平

3 討論

PPARs屬于核受體超家族的轉錄因子，有α、β、γ 3種亞型。人PPARγ基因定位于3p25，其在一系列病理和生理過程中發揮重要作用［5］。PPARγ激動劑羅格列酮、吡格列酮等能促進其表達。陳文雁等［6］發現PPARγ1過表達對大鼠心肌有保護作用。而Loebstein等［7］發現長期采用羅格列酮治療的2型糖尿病患者心血管風險事件增加。Palee等［8］研究發現羅格列酮能增加缺血/再灌注后的室顫傾向。本研究發現ROS組大鼠較其他組大鼠更易出現心律失常，具體表現為室速持續次數、時間增加，短期改變明顯，室顫增加及室顫發作時間縮短，且2只大鼠死于再灌注過程；ROS組大鼠再灌注1 h、2 h時心電圖QTc間期延長較其他組顯著，與國外文獻報道相似［8-9］。

正常情況下心肌低表達PPARγ。Lee等［10］研究表明PPARγ在糖尿病相關的心臟疾病中表達升高。Morrow等［9］研究發現吡格列酮預處理轉基因模型小鼠PPARγ過表達可增加室性心律失常發生率。本研究發現，缺血/再灌注模型大鼠PPARγ表達上調，羅格列酮預處理后進一步促進PPARγ表達。ROS組大鼠再灌2 h后QTc間期較其他組顯著延長，可能與心室復極受損有關。而使用PPARγ抑制劑GW9662干預后，惡性心律失常發生率明顯減低，較I/R組及ROS組PPARγ表達下調，推測PPARγ可能介導了再灌注心律失常。過高的PPARγ表達可能會使心肌細胞脂質異常蓄積和心肌電生理發生重構，而心肌細胞動作電位的復極相依賴于鈉離子和鈣離子去極化與鉀離子復極化的平衡，正常心律的發生基于鈉、鉀、鈣離子通道的正常開放關閉；心肌細胞脂質蓄積和心肌電重構影響正常離子通道的開放和關閉，尤其是鉀離子通道開放減緩甚至減少，引起動作電位時相延長，從而導致心室除極和復極異常，心電圖表現為室性心律失常。本研究也存在不足之處，未進行大鼠心肌電生理研究，無法檢測離子通道的變化過程。

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（2014-10-28收稿 2014-12-02修回）

（本文編輯 胡小寧）

Effects of PPARγ on malignant arrhythmia in myocardial ischemia/reperfusion model rats

HE Xueshu，MO Xinling△，CHEN Hua，XIE Ting
Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，China
△Corresponding Author E-mail:glmxl1003@163.com

Objective To investigate the effects of peroxisome proliferator activated receptor gamma（PPARγ）on malignant arrhythmia in myocardial of ischemia/reperfusion（I/R）rats.Methods Twenty-four SD rats were randomly divided into four groups:Sham group，I/R group，rosiglitazone（ROS）group and PPARγ inhibitor GW9662（GW）group.The myocardial I/R injury was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery，with ischemia for 30 min and reperfusion for 2 h.The whole process limbⅡlead electrocardiogram was applied to observe the frequency of malignant arrhythmia and record the corrected changes of QT（QTc）interval.RT-PCR was used to detect the expression of PPARγ mRNA.Results There were 5 cases of malignant arrhythmia in ROS group，2 in I/R and 1 in GW group，0 was found in Sham group.There was a prolongation of the QTc interval in ROS group than the other groups after ischemic stage（P＜0.05）.Compared with I/R group and ROS group，the QTc intervals were shorten in ischemia 30 min and reperfusion process in GW group（P＜0.05）.Compared with sham group，the expression of PPARγ mRNA was significantly increased in other three groups（P＜0.05）.The expression level of PPARγ mRNA was the highest in ROS group.The expression level of PPARγ mRNA was reduced in GW group compared with that of I/R group and ROS group（P＜0.05）.Conclusion Over expression of PPARγ may lead to the occurrence of malignant arrhythmia in myocardial ischemia/reperfusion rats.

PPAR gamma；myocardium；reperfusion injury；arrhythmia；rosiglitazone

R541.7

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.011

廣西壯族自治區衛生廳自籌課題（Z2013492）；廣西壯族自治區衛生廳重點科研課題（重2010049）

桂林醫學院附屬醫院心內科（郵編541001）

何學恕（1985），男，碩士在讀，主要從事高血壓、冠心病的防治研究

△E-mail:glmxl1003@163.com