丹皮酚對急性心肌梗死后心室重構模型大鼠RAS的影響

顧媛媛，周曉慧，徐倩，趙靜怡

實驗研究

丹皮酚對急性心肌梗死后心室重構模型大鼠RAS的影響

顧媛媛，周曉慧△，徐倩，趙靜怡

目的 觀察丹皮酚對急性心肌梗死（AMI）后心室重構模型大鼠腎素-血管緊張素系統（RAS）的影響。方法 對健康雄性SD大鼠進行左冠狀動脈前降支結扎，復制AMI模型。設假手術組、模型組、卡托普利組、丹皮酚低劑量（6 mg/kg）組、丹皮酚中劑量（9 mg/kg）組和丹皮酚高劑量（12 mg/kg）組。造模成功并存活下來的大鼠，分別給予各組不同藥物處理。用藥4周后取材，采用HE染色法觀察心肌組織病理變化；采用實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測各組心肌組織中血管緊張素原（AGT）、血管緊張素Ⅱ受體（AGTR）1和內皮縮血管肽1（ET）-1 mRNA水平表達情況并進行分析；采用蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測各組大鼠心肌組織中肽基二肽酶A（ACE），血管緊張素Ⅱ（Ang）-Ⅱ和AGTR1的蛋白表達水平。結果 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中AGT、AGTR1、ET-1 的mRNA表達明顯升高，Ang-Ⅱ、ACE、AGTR1的蛋白表達亦顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，其在丹皮酚高劑量組和卡托普利組心肌組織中mRNA表達以及蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。丹皮酚對降低其mRNA表達和蛋白表達存在明顯的劑量依賴性。結論 丹皮酚能夠延緩大鼠AMI后心室重構，其機制可能與抑制RAS的過度激活有關。

心肌梗死；心室重構；腎素-血管緊張素系統；血管緊張素原；血管緊張素Ⅱ受體1；內皮縮血管肽1；肽基二肽酶A；血管緊張素Ⅱ；丹皮酚

心肌梗死過程中，由于心室長時間受壓力負荷、容量負荷及心肌損傷刺激，可導致心室發生病理改變［1］，即心室重構。心室重構的發生發展過程復雜，越來越多的學者認為，由于活性氧增多導致氧化應激反應的發生和局部產生的血管緊張素（Ang）-Ⅱ在心肌梗死后的心室重構中起到了重要的作用［2］，Ang-Ⅱ是腎素-血管緊張素系統（RAS）關鍵因子。RAS的激活在包括急性心肌梗死（AMI）在內的心血管疾病中發揮著重要作用［3］。丹皮酚藥理活性廣泛，前期研究證實，丹皮酚可以通過減輕炎癥反應抑制AMI后心室重構［4］。關于丹皮酚能否通過抑制RAS的激活改善AMI后心室重構作用鮮見報道。本研究旨在探討丹皮酚對AMI后心室重構模型大鼠RAS的影響，為丹皮酚抗心肌梗死后心室重構的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 丹皮酚注射液購自寧波天真制藥有限公司；卡托普利片購自北京亞寶生物藥業有限公司；注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司；Trizol購自invitrogen公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）購自大連寶生物工程有限公司；兔抗鼠GAPDH一抗購自Epitomics公司；兔抗鼠血管緊張素Ⅱ受體1（AGTR1）一抗購自Affinity公司；兔抗鼠肽基二肽酶A（ACE）一抗購自Abcam公司；兔抗鼠Ang-Ⅱ一抗購自EterLife公司；二抗（山羊抗兔IgG/辣根酶標記）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECG-11D心電圖機購自惠州科美思醫用儀器有限公司；DW3000-B型小動物人工呼吸機購自淮北正華生物科技有限公司；高速冷凍離心機購自Sigma公司；實時熒光定量（Real-Time）PCR儀Mx3000P購自美國安捷倫Stratagene公司；DYY-8c型轉移電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.2 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠60只，體質量（250±20）g，購自北京華阜康生物技術有限公司。適應性飼養1周，將大鼠按體質量編號，采用隨機區組方法，將實驗大鼠分為6組，分別為假手術組、模型組、丹皮酚低、中、高劑量組和卡托普利組。

1.3 AMI模型的制備 給大鼠腹腔注射8%水合氯醛，待大鼠完全麻醉后，打開氣管插入呼吸機，于大鼠左三、四肋間開胸暴露心臟，在其心耳下緣2 mm左右處找到其左冠狀動脈前降支并進行結扎（假手術組只穿線不結扎）。結扎完成后逐層、快速地縫合肌肉和皮膚。觀察心電圖，以ST段明顯抬高作為判斷AMI模型成功的標準。給術后成活的大鼠注射青霉素鈉3 d后，再次進行心電圖檢查，若仍然存在ST段抬高，則模型建立成功。給予各組造模成功并存活下來的大鼠相應藥物處理，分別為丹皮酚組（低6 mg/kg、中9 mg/kg、高12 mg/kg）、卡托普利組（10 mg/kg），模型組和假手術組以等量生理鹽水灌胃。各組大鼠給藥時間均為4周。4周后取材，一部分組織進行固定，用于HE染色；一部分放入液氮中冷凍，繼而放入-80℃冰箱保存，用于Real-Time PCR和Western blot實驗。

1.4 心肌組織病理變化觀察 在結扎線以下切取3～5 mm心肌組織，于4%多聚甲醛內固定。24 h后，采用常規石蠟包埋，5 μm連續切片，HE染色觀察心肌組織的病理變化。

1.5 Real-Time PCR檢測各組心肌組織中AGT、AGTR1、ET-1表達 引物由大連寶生物公司設計合成。β-actin引物：上游5′-GGAGATTACTGGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′；AGT引物：上游5′-GCTTGTCTGGGCTGGAGCTAA-3′，下游5′-GACCCAGGTCAGGATGCAGAA-3′；AGTR1引物：上游5′-GATTCGTGGCTTGAGTCCTGT-3′，下游5′-TCTGGGAGGGTTGTGTGATTT-3′；ET-1引物：上游5′-ACATTCCAAGAGAGGTTGAGGTG-3′，下游5′-AGACAGCAAGAAGAGGCAAGAGA-3′。按照Trizol核酸提取試劑要求提取各組總RNA，檢測總RNA的純度和濃度，純度在1.8～2.0左右為好。按照Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行逆轉錄反應合成cDNA后進行Real-time PCR檢測，擴增條件為95℃預變性30 s，95℃5 s、55℃30 s，擴增40個循環，在55℃讀取熒光，每個指標檢測3次，取平均值。每個反應孔內熒光信號達到設定閾值時所對應的循環次數即Ct值，目的基因Ct值與內參基因Ct值進行標準化處理，依據 2-ΔΔCt法［5］對目的基因表達進行相對定量分析。ΔΔCt=（待測組目的基因Ct均值-待測組內參照基因Ct均值）-（對照組目的基因Ct均值-對照組內參照基因Ct均值）［6］。

1.6 Western blot檢測各組心肌組織中ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1蛋白表達 取50 mg大鼠梗死區心肌組織，剪碎，放入RIPA裂解液中，冰上勻漿，離心取上清。按BCA法蛋白定量試劑盒說明書測量各組樣品總蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按1∶4比例混合均勻，95℃水浴10 min使蛋白變性，分裝并保存在-80℃冰箱內。根據目的蛋白分子質量配膠，取蛋白樣品上樣電泳，轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫搖床上孵育3 h，二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗滌。ECL試劑作用，置于暗室曝光、顯影，使用Quantity One軟件分析顯影條帶，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）形式表示，若數據符合正態分布并且方差齊，采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 假手術組心肌細胞規則排列，細胞核清晰可見；模型組心肌細胞有肥大、壞死現象，排列紊亂，細胞核有固縮或消失現象；與模型組比較，丹皮酚低、中、高劑量組和卡托普利組心肌組織病理變化均有不同程度的減輕，其中丹皮酚高劑量組和卡托普利組改善最為明顯，見圖1。

Fig.1 Observation of myocardial tissue under optical microscope in six groups of rats（HE，×200）圖1 各組大鼠心肌組織光鏡觀察（HE，×200）

2.2 Real-Time PCR檢測結果 與假手術組比較，模型組心肌組織AGT、AGTR1和ET-1 mRNA表達均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，丹皮酚高劑量組和卡托普利組心肌組織3種mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；丹皮酚中劑量組心肌組織AGT和AGTR1 mRNA表達亦顯著降低（P＜0.05），ET-1 mRNA表達無明顯變化，差異無統計學意義；丹皮酚低劑量組心肌組織AGT mRNA表達顯著降低（P＜0.05），AGTR1和ET-1 mRNA表達無明顯變化，差異無統計學意義，見表1。

Tab.1Comparison of AGT，AGTR1 and ET-1 mRNA expression in myocardial tissue between six groups表1 各組心肌組織中AGT、AGTR1和ET-1mRNA表達的比較 （n=3，2-ΔΔCt，±s）

Tab.1Comparison of AGT，AGTR1 and ET-1 mRNA expression in myocardial tissue between six groups表1 各組心肌組織中AGT、AGTR1和ET-1mRNA表達的比較 （n=3，2-ΔΔCt，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05，表2同

組別假手術組模型組丹皮酚低劑量組丹皮酚中劑量組丹皮酚高劑量組卡托普利組F AGT 1.00±0.00 192.67±31.96a23.35±0.80b5.41±1.54b2.10±0.95b0.97±0.32b68.406＊＊AGTR1 1.00±0.00 2.07±0.30a1.70±0.52a1.19±0.32b0.82±0.03b0.92±0.67b4.825＊ET-1 1.00±0.00 1.95±0.20a1.31±0.22 1.44±0.74 0.74±0.62b0.75±0.25b3.588＊

2.3 Western blot檢測結果 與假手術組比較，模型組心肌組織中ACE、Ang-Ⅱ和AGTR1的蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，除丹皮酚低劑量組中AGTR1蛋白表達無明顯變化外，其余各組3種蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）；見圖2～4，表2。

Fig.2 ACE protein expression in myocardial tissue of six groups圖2 各組大鼠心肌組織ACE蛋白表達情況

Fig.3 Ang-Ⅱprotein expression in myocardial tissue of six groups圖3 各組大鼠心肌組織Ang-Ⅱ蛋白表達情況

Fig.4 AGTR1 protein expression in myocardial tissue of six groups圖4 各組大鼠心肌組織AGTR1蛋白表達情況

3 討論

心肌梗死后，由于心肌缺血、缺氧導致心臟排出量下降，交感神經興奮，加上腎臟血管收縮、血流量下降，導致腎灌注量及灌注壓下降，腎小球旁器細胞分泌并釋放的腎素增加，RAS被激活［7］，AGT在腎素作用下產生不具生物活性的血管緊張素Ⅰ，經ACE作用產生Ang-Ⅱ。Ang-Ⅱ具有強大的收縮血管功能，Ang-Ⅱ的增多可促使ET-1分泌增多。ET-1能使血管阻力升高、血管平滑肌增殖，同時ET-1也具有激活RAS的作用，最終導致心肌細胞肥大和成纖維細胞增生，直接促進心室重構。另外，Ang-Ⅱ也能通過內分泌或旁分泌的方式與AGTR1作用，導致血管收縮、心肌細胞生長、成纖維細胞增殖，促使心室肥大和纖維化，加速心室重構，最終導致心力衰竭。

Tab.2 Comparison of ACE，Ang-Ⅱand AGTR1 protein expression in myocardial tissue between six groups表2 各組心肌組織中ACE、Ang-Ⅱ和AGTR1蛋白相對表達量的比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of ACE，Ang-Ⅱand AGTR1 protein expression in myocardial tissue between six groups表2 各組心肌組織中ACE、Ang-Ⅱ和AGTR1蛋白相對表達量的比較 （n=3，±s）

組別ACE/GAPDHAng-Ⅱ/GAPDHAGTR1/GAPDH假手術組0.034±0.0040.029±0.0020.023±0.002模型組1.006±0.012a0.800±0.020a0.956±0.016a丹皮酚低劑量組0.974±0.031b0.764±0.038b0.976±0.027丹皮酚中劑量組0.655±0.006b0.616±0.012b0.855±0.025b丹皮酚高劑量組0.505±0.176b0.263±0.006b0.633±0.045b卡托普利組0.434±0.013b0.221±0.301b0.141±0.136bF 1 464.235＊＊838.659＊＊828.815＊＊

課題組前期研究顯示，丹皮酚可使血流動力學指標左心室收縮壓（LVSP）及左心室內壓最大上升速率與最大下降速率（±dP/dtmax）升高，左心室舒張壓（LVEDP）降低，大鼠心肌纖維化程度明顯減輕，證實丹皮酚能夠改善大鼠心肌梗死后的心室重構［8］。本研究HE染色顯示，大鼠AMI后心肌組織細胞出現明顯的肥大、壞死現象；丹皮酚藥物干預4周后，心肌病理組織形態變化得到不同程度的恢復，表明丹皮酚對大鼠心肌梗死后心室重構有一定的改善作用。心肌梗死后大鼠心肌組織中AGT、AGTR1、ET-1 mRNA水平表達均明顯升高；ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1的蛋白表達亦顯著升高。丹皮酚藥物干預4周后，與模型組比較，大鼠心肌組織中AGT、AGTR1、 ET-1 mRNA水平表達均顯著降低；ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1的蛋白表達亦顯著下降，并且存在明顯的劑量依賴性。提示丹皮酚能夠抑制心梗后心室重構大鼠心肌組織AGT、AGTR1、ET-1 mRNA水平，以及ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1蛋白水平的表達。

綜上，丹皮酚能夠抑制AGT、ACE的表達而降低Ang-Ⅱ的水平，進而使ET-1表達下調；同時丹皮酚還將抑制AGTR1的表達，減少Ang-Ⅱ與AGTR1的結合。因而推斷，丹皮酚逆轉心肌梗死后大鼠的心室重構可能是從多個環節阻斷RAS作用的，然而其具體分子機制尚不十分明確，有待于深入研究。

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（2014-08-29收稿 2015-01-12修回）

（本文編輯 李國琪）

Effects of paeonol on RAS occurred on the development of ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats

GU Yuanyuan，ZHOU Xiaohui△，XU Qian，ZHAO Jingyi
Chengde Medical College，Chengde 067000，China
△Corresponding Author E-mail:zxh5055@sina.com

Objective To investigate the effects of paeonol on renin-angiotensin system（RAS）occurred on the development of ventricular remodeling after acute myocardial infarction（AMI）in rats.Methods The left anterior descending coronary artery was ligated to establish the model of AMI in male SD rats.Six groups were set up:sham-operation group，AMI model group，captopril control group，paeonol low dose group（6 mg/kg），paeonol middle dose group（9 mg/kg）and paeonol high dose group（12 mg/kg）.Rats were given treatment for 4 weeks after the AMI model was established.HE staining was used to observe changes of myocardial tissue.Real-time PCR was used to detect the mRNA levels of angiotensinogen（AGT），angiotensinⅡreceptor type1（AGTR1）and endothelin（ET）-1 of six groups.Western blot assay was used to detect the protein levels of peptidyl-dipeptidase A（ACE），angiotensinⅡ（Ang）-Ⅱand AGTR1 in six groups.Results The transcription of AGT，AGTR1，ET-1mRNA and the expressions of ACE，Ang-Ⅱand AGTR1protein were significantly higher in myocardial tissue of AMI rats than those of sham-operation rats（P＜0.05）.Compared with model group，the expressions of AGT，AGTR1，ET-1mRNA and ACE，Ang-Ⅱ，AGTR1 protein were significantly decreased in paeonol high dose group and captopril control group（P＜0.05）.Paeonol reduced the expressions of those mRNA and protein levels in a significant dose dependent manner.Conclusion Paeonol can slow down the deterioration of the ventricular remodeling after AMI in rats，which may be related to the inhibition of over-activation of RAS.

myocardial infarction；ventricular remodeling；renin-angiotensin system；angiotensinogen；angiotensinⅡreceptor type1；endothelin-1；peptidyl-dipeptidase A；angiotensinⅡ；paeonol

R541

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.006

河北省自然科學基金資助項目（C2011406009）；河北省醫學科學研究重點課題計劃（20100137）

承德醫學院中藥研究所（郵編067000）

顧媛媛（1989），女，碩士研究生，主要從事分子藥理研究

△E-mail:zxh5055@sina.com