五味子乙素對HK-2細胞缺氧損傷的保護作用

盧愛龍，譚小月，張勉之，吳銀娜

五味子乙素對HK-2細胞缺氧損傷的保護作用

盧愛龍1，譚小月2，張勉之3△，吳銀娜1

目的 探討五味子乙素（Sch B）對氯化鈷（CoCl2）誘導的人類近端腎小管上皮（HK-2）細胞缺氧損傷的保護作用及其可能機制。方法 取離體培養HK-2細胞，隨機分為4組。對照（C）組：細胞未經任何處理。CoCl2組（化學乏氧組）：加入600 μmol/L的CoCl2處理24 h。Sch B預保護（CoCl2+Sch B）組：分別加入終濃度為1 μmol/L和10 μmol/L Sch B預處理2 h后，其余操作同CoCl2組。Sch B組：分別加入終濃度1 μmol/L和10 μmol/L Sch B處理2 h。CCK-8試劑盒檢測各組細胞活性；AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率；Western Blot檢測各組缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白表達；RT-PCR檢測各組HIF-1α和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達。結果 與對照組相比，CoCl2組細胞活性明顯降低，細胞凋亡率、HIF-1α蛋白表達量和iNOS mRNA表達量顯著增加，HIF-1α mRNA表達量差異無統計學意義；Sch B預保護組較CoCl2組細胞活性顯著增加，細胞凋亡率、HIF-1α蛋白表達量、HIF-1α及iNOS mRNA表達量均顯著減少；Sch B組與對照組細胞活性、細胞凋亡率差異無統計學意義，Sch B組幾乎不表達HIF-1α蛋白。結論 Sch B可能通過抑制HIF-1α蛋白和iNOS mRNA的表達減少HK-2細胞的凋亡，從而對HK-2細胞缺氧損傷起保護作用。

細胞凋亡；缺氧誘導因子1，α亞基；一氧化氮合酶；五味子乙素；HK-2細胞；氯化鈷；誘導型一氧化氮合酶

腎缺血再灌注損傷是一種嚴重的臨床并發癥，常見于失血性休克、腎移植、腹主動脈瘤手術等危重癥患者。探索對缺血再灌注損傷具有保護作用的藥物一直是研究熱點。五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是從中藥五味子中分離的聯苯環辛二烯木脂素類有效成分，是五味子中含量較多的有效成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、護肝等作用。研究表明，Sch B對心［1］、腦［2］缺血再灌注損傷均具有保護作用。而且，Sch B具有顯著的腎臟保護作用，對急性汞中毒引起的腎小球和腎小管損傷［3］，以及環孢素A［4］、順鉑［5］等腎毒性藥物造成的腎損害均有保護作用。但目前關于Sch B對腎缺血再灌注損傷的研究尚較少。缺氧是缺血再灌注損傷中的關鍵環節。腎臟管狀上皮細胞的高水平氧耗量及腎臟的特殊脈管系統結構使得腎臟對缺氧非常敏感，而近曲腎小管上皮細胞對缺氧損傷尤為敏感。基于此，本實驗擬從體外水平檢測Sch B對氯化鈷（CoCl2）誘導的腎小管上皮細胞缺氧損傷的保護作用，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類近端腎小管上皮（HK-2）細胞購自美國模式菌種收集中心（ATCC）細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器 五味子乙素（純度99%）購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，二甲基亞砜溶解配制成10 mmol/L母液，CoCl2（美國，Sigma），CCK-8試劑盒（日本，dojindo），AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國，BD），缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體（美國，proteintech），β-actin單克隆抗體（美國，Santa Cruz），RNA抽提試劑Trizol（美國，Invitrogen），逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）試劑盒（北京全式金），聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀、臺式高速離心機及凝膠成像系統（美國，Bio-Rad），酶標儀（美國，Thermo），引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 細胞培養 細胞在含10%胎牛血清，1%雙抗（100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈霉素）的DMEM-F12培養基中，于5% CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養。細胞貼壁生長，每2 d進行細胞換液，長至80%左右融合后以0.25%胰酶消化傳代。

1.4 分組及處理 以HK-2細胞培養皿或孔板為觀察單位，隨機分為4組：對照（C）組：細胞未經任何處理。CoCl2組（化學乏氧組）：加入600 μmol/L的CoCl2處理24 h。Sch B預保護（CoCl2+Sch B）組：分別加入終濃度為1 μmol/L和10 μmol/L Sch B預處理2 h后，其余操作同CoCl2組。Sch B組：分別加入終濃度1 μmol/L和10 μmol/L Sch B處理2 h。

1.5 指標檢測

1.5.1 CCK-8試劑盒檢測HK-2細胞活性 在96孔板培養細胞，每孔5 000個細胞，細胞貼壁后，換無血清培養基培養16 h使細胞周期同步化，然后按上述分組進行處理。處理完成后每孔加CCK-8試劑10 μL，37℃孵育1 h，選擇450 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光密度（OD）值，并計算細胞活性。細胞活性（%）=（OD加藥－OD空白）/（OD對照－OD空白）×100%

1.5.2 AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測細胞凋亡率 待細胞在6孔板中培養至對數生長期，換無血清培養基培養16 h使細胞周期同步化，再按上述分組加藥處理后，胰酶消化收集各組細胞，2 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌細胞2次（2 000 r/min離心5 min），用500 μL緩沖液重懸細胞后，先加入5 μL AnnexinV-FIFC染色液混勻后，再加入5 μL PI染色液，混勻后室溫避光孵育10 min。篩網過濾后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。FlowJo軟件計算分析各組細胞AnnexinV-FIFC和PI染色細胞百分含量。

1.5.3 Western Blot檢測HIF-1α蛋白表達 接種于6孔板中的各組細胞以預冷PBS液洗2次，加入50 μL預冷蛋白裂解液，冰上裂解30 min，細胞刮刀收集樣本。2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量、配樣，100℃、10 min變性后上樣。經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用等滲鹽溶液加Tris-HCL緩沖液（TBST）沖洗后加HIF-1α及β-actin的一抗，4℃孵育過夜。TBST液沖洗，加標記辣根過氧化物酶的二抗孵育。洗膜后ECL顯色，X線片曝光，沖洗，掃描。以β-actin為內參，檢測HIF-1α蛋白的表達。

1.5.4 RT-PCR檢測HIF-1α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表達 采用Trizol試劑盒從接種到6孔板中的各組細胞提取總mRNA。紫外分光光度儀檢測mRNA的含量和純度。用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，瓊脂凝膠電泳，凝膠成像系統成像后以GAPDH為內參，用Image J數碼圖像分析軟件進行分析，以擴增片段與GAPDH的灰度比值表示產物多少，進行半定量分析。HIF-1α引物上游 5′-GGAAACTTCTGGATGCTGGTG-3′，下游5′-TTCCTCGGCTAGTTAGGGTAC-3′，擴增片段330 bp；iNOS引物上游5′-CCACCAACAATGGCAACATCAGG-3′，下 游 5′-AGGCAGGGCGTACCACTTTAGCT-3′，擴增片段350 bp；GAPDH引物為上游5′-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′，擴增產物片段為299 bp。逆轉錄反應條件：42℃30 min，85℃5 min。PCR條件：94℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，33個循環。

1.6 統計學方法 用SigmaStat 3.5統計軟件分析數據，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活性 與對照組相比，CoCl2組細胞活性明顯降低，Sch B預保護組較CoCl2組細胞活性顯著增加（P＜0.01），Sch B組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 細胞凋亡率 見圖1、表1。與對照組相比，CoCl2組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.001），Sch B預保護組較CoCl2組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Sch B組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

Fig.1 Results of apoptosis detected by flow cytometry in six groups of cells圖1 各組細胞流式細胞檢測凋亡圖

Tab.1 Comparison of the cell viability and apoptotic rates in six groups of cells表1 各組細胞的細胞活性和凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of the cell viability and apoptotic rates in six groups of cells表1 各組細胞的細胞活性和凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05

組別對照組（1）CoCl2組（2）1 μmol/L Sch B預保護組（3）10 μmol/L Sch B預保護組（4）1 μmol/L Sch B組（5）10 μmol/L Sch B組（6）F細胞活性100.000±0.000 57.710±0.957a73.420±4.932ab81.283±2.808abc93.490±3.291bcd94.137±6.854bcd17.554＊＊細胞凋亡率7.110±0.417 14.897±0.303a12.880±0.734ab11.767±0.677ab8.463±0.600bcd8.383±0.465bcd30.489＊＊

2.3 對HIF-1α蛋白表達量的影響 與對照組相比，CoCl2組HIF-1α蛋白表達量顯著增加（P＜0.001），Sch B預保護組較CoCl2組顯著降低（P＜0.01），Sch B組幾乎不表達HIF-1α蛋白，見圖2、表2。

Fig.2 The expression of HIF-1α in six groups of cells圖2 各組細胞HIF-1α的表達情況

2.4 對HIF-1α、iNOS mRNA表達的影響 與對照組相比，CoCl2組HIF-1α mRNA表達量差異無統計學意義（P＞0.05），iNOS mRNA表達量顯著增加（P＜0.01），Sch B預保護組HIF-1α及iNOS mRNA表達量均較CoCl2組顯著減少（P＜0.05），見圖3、表2。

3 討論

3.1 凋亡在細胞缺氧損傷中的作用 細胞凋亡是在正常生理或病理狀態下機體細胞發生的一種自發的、程序化的死亡過程，是缺氧誘導腎小管上皮細胞損傷的主要機制之一［6］。本實驗結果表明，CoCl2誘導的HK-2細胞缺氧導致細胞活性顯著下降，凋亡率顯著增加。

Fig.3 The expressions of HIF-1α mRNA and iNOS mRNA in six groups of cells圖3 各組細胞HIF-1α及iNOS mRNA的表達情況

Tab.2 Comparison of HIF-1α expression and HIF-1α，iNOS transcription between six groups表2 各組HIF-1α蛋白及HIF-1α、iNOS mRNA表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of HIF-1α expression and HIF-1α，iNOS transcription between six groups表2 各組HIF-1α蛋白及HIF-1α、iNOS mRNA表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，e與（5）組比較，P＜0.05

?

3.2 HIF-lα在細胞缺氧損傷中的作用 在缺氧條件下機體或細胞會產生一系列的缺氧應答反應，而這些缺氧應答反應主要通過缺氧誘導因子（HIF）來調控。HIF作為氧自穩調節的關鍵性轉錄因子，能夠調節百余種靶基因的表達，從而使得機體或細胞對缺氧缺血性損傷產生適應性反應。目前發現HIF家族共有3個成員，包括HIF-l、HIF-2和HIF-3，其中HIF-l廣泛分布于哺乳動物和人體細胞內。在腎臟缺氧缺血損傷中，HIF-1主要表達在腎小管上皮細胞上。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的一種異二聚體，其中α亞基是功能性亞基，β亞基是結構性亞基。缺氧誘導細胞產生HIF-lα，通過調控一系列與適應缺氧有關的轉錄基因的表達，調節機體針對缺氧環境的適應性。HIF-1α介導一系列適應性反應的同時也誘導了很多病理性反應，如細胞凋亡［7］。本實驗結果表明，HIF-1α蛋白的高表達與HK-2細胞的活性下降及凋亡增加相關，說明HIF-1α蛋白可能誘導HK-2細胞的凋亡。HIF-1α蛋白非缺氧時容易降解，但在缺氧時則降解阻止。研究發現：除嚙齒類動物外，缺氧條件下HIF-1的調節性亞基HIF-1α在mRNA轉錄水平上并沒有顯著性變化，而是經過阻滯蛋白酶體通路活性，使本應降解掉的HIF-1α蛋白堆積，進而影響下游各個基因的表達［8］。本實驗結果表明，對照組與CoCl2組HIF-1α mRNA表達無顯著差異，但CoCl2組HIF-1α蛋白表達較對照組顯著增加，與既往研究結果一致。

3.3 iNOS在細胞缺氧損傷中的作用 內源性NO 由L-精氨酸氧化而來，催化該反應的酶即為一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）。NOS有3個同工酶亞型：神經型NOS（nNOS）、內皮型NOS（eNOS）和iNOS。iNOS在正常細胞內一般是少量表達的，當細胞受到缺氧等病理刺激時，iNOS催化合成非生理濃度的大量NO，產生一系列病理生理作用。盡管NO能維持黏膜的血管舒張和血管通透性，但是過多的NO也可直接引起細胞毒性作用，與氧自由基結合生成過氧亞硝酸等，從而引起組織損傷［9］。HIF-1α是iNOS基因轉錄活化的重要調節因子。有研究發現iNOS基因表達調控區內具有HIF-1α的結合位點；HIF-1α與iNOS基因調控區的特異位點結合進而調節其表達［10］。本實驗結果表明，CoCl2組iNOS mRNA表達量顯著增加，與HIF-1α的增加一致。

3.4 Sch B保護細胞缺氧損傷 五味子是臨床常用中藥之一，具有斂肺生津、補腎養心、收斂固澀等功效，其提取物對各種器官如肝臟、心臟、腎臟等的損傷具有保護作用，能拮抗阿霉素對體外培養足細胞的損傷作用［11］。Sch B是從五味子中提取的中藥單體，既往研究結果表明，其具有抗氧化、抗腫瘤等作用，對心腦肝腎等重要器官均具有保護作用，而且對機體正常的細胞沒有毒性作用。本研究初步證實Sch B可能通過抑制HIF-1α蛋白和iNOS mRNA的表達減少HK-2細胞的凋亡，從而對HK-2細胞缺氧損傷起保護作用，但其具體機制還需要進一步研究。

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（2015-03-04收稿 2015-03-18修回）

（本文編輯 李鵬）

Protective effects of schisandrin B on hypoxia injury of HK-2 cells

LU Ailong1，TAN Xiaoyue2，ZHANG Mianzhi3△，WU Yinna1
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Medical School of Nankai University；3 Tianjin Gongan Hospital
△Corresponding Author E-mail:zhangmianzhi@vip.sina.com

Objective To explore the protective effects of schisandrin B（Sch B）on hypoxia injury induced by cobaltous chloride（CoCl2）in human proximal renal tubular epithelial（HK-2）cells，and the possible mechanism thereof.Methods HK-2 cells were randomly assigned to four groups:control group（Con，cells were untreated），CoCl2group（CoCl2，cells were treated with 600 μmol/L CoCl2for 24 h），Sch B pretreat group（CoCl2+Sch B，cells were pretreated with 1 μmol/L and 10 μmol/L Sch B for 2 h）and Sch B group（Sch B，cells were treated with 1 μmol/L and 10 μmol/L Sch B for 2 h）.CCK-8 kit was used to detect the cell viability of four groups.Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of four groups.The protein expression of hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α）was assessed by Western blot assay.The expressions of HIF-1α and inducible nitric oxide synthase（iNOS）mRNA were determined by RT-PCR.Results Compared with the control group，after treated with 600 μmol/L CoCl2，the cell viability was decreased，and the apoptosis was increased，the expressions of HIF-1α and iNOS mRNA were up-regulated in HK-2 cells.There was no significant difference in the expression of HIF-1α mRNA between control group and CoCl2group.Compared with the CoCl2group，after pretreated with 1 μmol/L and 10 μmol/L Sch B，the cell viability was increased and the apoptosis was decreased，the expressions of HIF-1α and iNOS were down-regulated in HK-2 cells.There were no significant differences in the cell viability and apoptotic rate between control group and Sch B group.Conclusion Pretreatment with Sch B can reduce the apoptosis of HK-2 cells by inhibiting the expression of HIF-1α and iNOS mRNA，which shows protective effects on hypoxia injury.

apoptosis；hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；nitric oxide synthase；schisandrin B；HK-2 cells；cobaltous chloride；inducible nitric oxide synthase

R692

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.005

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（14JCYBJC28200）

1天津醫科大學（郵編300070）；2南開大學醫學院；3天津市公安醫院

盧愛龍（1988），男，碩士研究生在讀，主要從事腎缺血再灌注損傷研究

△E-mail：zhangmianzhi@vip.sina.com