GLP-1通過SDF-1/CXCR4信號通路調控人臍血內皮祖細胞增殖、分化和凋亡

劉峰，許文瓊，閔娜，湯佳珍，黃海華

GLP-1通過SDF-1/CXCR4信號通路調控人臍血內皮祖細胞增殖、分化和凋亡

劉峰1，許文瓊1，閔娜2，湯佳珍1，黃海華1

目的 探討胰高血糖素樣肽1（GLP-1）調控人臍血內皮祖細胞（EPCs）增殖、分化與凋亡的分子機制。方法 從健康孕婦臍帶血分離和培養EPCs，以2×105密度接種于6孔細胞板，分別轉染空載體質粒（對照組）、pcDNA3-GLP-1質粒（GLP-1組）、pcDNA3-GLP-1質粒+AMD3100（GLP-1+AMD3100組）及單純AMD3100（AMD3100組）。將pcDNA3-GLP-1質粒轉染EPCs，以25 μmol/L AMD3100阻斷體外培養的EPCs的基質細胞衍生因子（SDF-1）/趨化因子受體4（CXCR4）信號通路1 h。采用RT-PCR檢測分化和凋亡相關基因PPARγ、C/EBPα與Caspase-3基因表達，MTT比色法檢測細胞增殖能力，Caspase-3活性檢測試劑盒測定Caspase-3活性。結果 與對照組相比，GLP-1過表達顯著提高了C/EBPα及PPARγ mRNA表達，促進了EPCs細胞增殖，降低了Caspase-3 mRNA表達和Caspase-3活性（均P＜0.05）。當SDF-1/CXCR4信號通路被阻斷后，GLP-1對C/EBPα及PPARγ mRNA表達、EPCs細胞增殖的促進作用，以及對Caspase-3 mRNA表達和Caspase-3活性的抑制作用均明顯減弱（均P＜0.05）。結論 GLP-1可通過調節SDF-1/CXCR4信號通路促進EPCs增殖與分化，抑制其凋亡。

胰高血糖素樣肽1；胎血；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；細胞增殖；細胞分化；細胞凋亡；內皮祖細胞；SDF-1/CXCR4；信號通路

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要來源于骨髓和外周血，在體外可誘導分化各種內皮細胞特異性抗原，在體內則能分化成有功能的內皮細胞［1］。目前，應用EPCs修復損傷血管已經成為研究熱點之一。有研究報道，胰高血糖素樣肽1 （glucagon like peptide 1，GLP-1）是一種促胰島素肽，具備多種生理功能，包括促進胰島β細胞增殖和分化、抑制食欲、增強記憶及改善心血管內皮細胞功能［2-3］。另有研究指出，基質細胞衍生因子（stromal cell derived factor，SDF-1）/趨化因子受體4（chemokinereceptor 4，CXCR4）可調節機體的炎癥與免疫反應，抵抗人類免疫缺陷病毒（HIV）感染，抑制腫瘤細胞遷移，保護胚胎發育，參與血管新生等［4-6］。本課題組前期研究證實，GLP-1可調控SDF-1與CXCR4 mRNA和蛋白表達［7］，由此推測GLP-1具有促EPCs增殖、移行與分化作用，且該機制可能與SDF-1/CXCR4通路有關。GLP-1是否通過調控SDF-1/CXCR4軸信號通路影響EPCs生物學效應尚少見研究。本研究采用阻斷劑AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4信號通路后，研究GLP-1對EPCs的增殖、分化及凋亡的影響，探討GLP-1調控的信號轉導機制，以期為血管并發癥的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞分離與培養 EPCs的分離和鑒定參照文獻［7］。無菌條件下，采用含肝素的注射器抽取健康孕婦臍帶血約20 mL。采用密度梯度離心法分離單個核細胞，并將其接種于24孔培養板，加入M199培養基，培養基含10%胎牛血清、1%鏈霉素、1%青霉素和 50 μg/L血管內皮生長因子（VEGF），置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2 主要試劑 CXCR4阻斷劑AMD3100購自AbMole公司，轉染試劑lipo2000購自英韋創津公司。實時定量PCR所用SYBR Green PCR Master Mix購自美國應用生物公司。β-actin（ab8229）、CXCR4抗體（ab2074）均購自Abcam公司，pcDNA3-GLP-1質粒由本實驗室構建，構建步驟參照文獻［6］。

1.3 實驗分組與處理 將體外培養的EPCs以2×105密度接種6孔細胞板。每組6個重復，每個重復6個復孔。分別轉染空載體質粒（對照組）、pcDNA3-GLP-1質粒（GLP-1組）、pcDNA3-GLP-1質粒+AMD3100（GLP-1+AMD3100組）及單純AMD3100（AMD3100組）。

1.4 Western Blot 將ECPs以2×105個/mL接種于6孔板，當細胞融合達65%時，加入0、5、15與25 μmol/L AMD3100阻斷劑，48 h后收集細胞并提取蛋白。經過電泳、轉膜后，取下硝酸纖維膜，脫脂牛奶封閉1 h后，用內參兔抗人β-actin一抗（ab8229）（1∶500）、兔抗人CXCR4一抗（ab2074，1∶500）孵育過夜，鼠抗兔二抗孵育1 h后顯色，進行化學發光反應并顯影、定影。將圖片掃描后，用Image J圖像分析軟件進行蛋白灰度分析。

1.5 實時定量PCR 將GLP-1過表達細胞后，采用AMD3100阻斷劑作用細胞24、48、96 h后行異硫氰酸胍/苯酚-氯仿萃取法，按照Trizol試劑盒說明從6孔板中提取總RNA（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。根據使用手冊，用ABI PRISM 7500熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）檢測PPARγ、C/EBPα與Caspase-3基因表達。PCR反應體系50℃2 min和95℃10 min，1個循環，以及95℃15 s，60℃15 s和72℃30 s，共40個循環。β-actin作為內參。特異性引物序列由上海博尚生物技術公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.6 MTT比色法 采用MTT比色法檢測GLP-1對SDF-1/ CXCR4信號通路阻斷后細胞增殖能力的影響。將ECPs轉染質粒后以1×104個/mL接種于96孔板，融合度達55%時，以25 μmol/L AMD3100作用細胞1 h。培養24、48、96 h后，向每孔中加入50 μL 2 g/L MTT溶液，再在培養箱繼續培養3 h。1 500 r/min離心5 min后移除細胞上清，每孔中加入150 μL DMSO。室溫下將細胞板置于振蕩器低速振蕩20 min，并于波長490 nm處測定其光密度（OD）值。

1.7 Caspase-3活性檢測 采用Caspase-3檢測試劑盒（Beyotime）檢測Caspase-3活性。將ECPs轉染質粒后以1×106個/mL接種于6孔板，當細胞融合達65%時加入25 μmol/L AMD3100作用1 h，培養24、48、96 h后收集細胞。PBS洗滌，采用蛋白裂解液分離細胞中的蛋白，并放置冰上待用。吸取50 μL細胞蛋白，加入50 μL反應緩沖液及加Ac-DEVD-AMC（Caspase-3四肽熒光底物）5 μL，于37℃避光孵育4 h。于405 nm波長處，用酶標儀測定其OD值。通過計算OD阻斷劑/OD陰性對照的倍數來確定凋亡誘導劑組Caspase-3活化程度。

1.8 統計學方法 數據采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，并行鄧肯氏多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阻斷效果分析 與對照組（0.465±0.085）相比，不同劑量AMD3100作用后，CXCR4蛋白表達明顯降低，25 μmol/L AMD3100組（0.054±0.023）作用最為明顯（F=16.347，P＜0.05），見圖1。證明25 μmol/L AMD3100阻斷效果最佳，可用于后續阻斷實驗。

Fig.1 Effects of AMD3100 inhibitor on CXCR4 protein expression圖1 AMD3100阻斷劑對CXCR4蛋白表達的影響

2.2 GLP-1對SDF-1/CXCR4信號通路阻斷后細胞分化的影響 與對照組相比，GLP-1過表達顯著提高了C/EBPα及PPARγ mRNA表達（P＜0.05），且具時間依賴性。當SDF-1/CXCR4信號通路被阻斷后，GLP-1對C/EBPα及PPARγ mRNA表達均明顯抑制（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Effects of GLP-1 on cell differentiation after the block of SDF-1/CXCR4 signaling pathway圖2 GLP-1對SDF-1/CXCR4信號通路阻斷后細胞分化的影響

2.3 GLP-1對SDF-1/CXCR4信號通路阻斷后細胞增殖的影響 與對照組相比，GLP-1過表達則明顯促進了細胞增殖（P＜0.05）。AMD3100阻斷劑阻斷SDF-1/CXCR4信號通路后，GLP-1對EPCs的增殖作用明顯降低（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Effects of GLP-1 on cell proliferation after the block of SDF-1/CXCR4 signaling pathway圖3 GLP-1對SDF-1/CXCR4信號通路阻斷后細胞增殖的影響

2.4 GLP-1對SDF-1/CXCR4信號通路阻斷后細胞凋亡的影響 與對照組相比，GLP-1過表達降低了Caspase-3 mRNA表達和Caspase-3活性，其均在GLP-1作用48 h后明顯降低，96 h時細胞表現出的下調趨勢最為顯著（P＜0.05）。當SDF-1/CXCR4信號通路被阻斷后，GLP-1對Caspase-3 mRNA表達和Caspase-3活性的抑制作用均明顯減弱（P＜0.05）。見圖4。

Fig.4 Effects of GLP-1 on cell apoptosis after block of SDF-1/CXCR4 signaling pathway圖4 GLP-1對SDF-1/CXCR4信號通路阻斷后細胞凋亡的影響

3 討論

GLP-1是由腸道L細胞分泌的一種多肽，其分泌受葡萄糖、脂肪等營養物質的調控［8-9］。有報道指出，GLP-1在改善心血管內皮細胞功能方面發揮重要作用［3］。EPCs是一種重要的促進血管新生的細胞，目前以EPCs為基礎的心血管疾病治療被廣泛關注［10］。目前，有關GLP-1在體外培養的EPCs中的調控機制尚少見報道。本文對GLP-1過表達后EPCs的生物學效應進行研究，發現GLP-1可通過SDF-1/ CXCR4信號通路調控EPCs的增殖、分化與凋亡。

對GLP-1功能的研究表明，GLP-1不但可以促使前胰島細胞向β細胞表型分化，而且可以增強胰島β細胞的增殖和存活［11］。此外，GLP-1還可以保護小鼠胰島β細胞免受過氧化氫誘導的凋亡，及阻止谷氨酸鹽誘導的大鼠海馬神經元細胞和成纖維細胞凋亡［12-13］。進一步研究證實，GLP-1抑制β細胞與心肌細胞調亡的途徑與PI3K/AKT信號途徑密切相關［11］。PPARγ與C/EBPα在細胞分化過程中發揮重要作用［14］。Caspase-3是Caspase家族的一員，在凋亡的信號傳導、調節和執行過程中發揮關鍵作用［15］。本研究結果顯示，GLP-1過表達促進了EPCs細胞增殖及PPARγ、C/EBPα mRNA表達，抑制了細胞Caspase-3 mRNA表達與Caspase-3活性。

SDF-1/CXCR4通路在內皮形成、血管生成以及造血等方面均發揮重要功能。有研究表明，SDF-1促進VEGF在內皮細胞上表達，是動員EPCs的重要細胞因子。SDF-1是CD34+造血祖細胞趨化因子，介導造血祖細胞的遷移，對祖細胞歸巢到骨髓起重要作用［16］。對SDF-1基因敲除小鼠的研究表明，SDF-1/CXCR4在心血管的生成中發揮重要作用［17］。SDF-1/CXCR4可觸發機體內多種信號轉導通路，包括PI3K/Akt、核因子（NF）-κB、MAPKs與Ca2+內流等，這些途徑被認為與細胞增殖與凋亡密切相關［13］。本研究證實，GLP-1是SDF-1/CXCR4通路的重要調控因子，并通過該通路調控EPCs的增殖、分化與凋亡。但由于體外實驗與體內復雜的環境還存在一定差距，尚需進一步深入研究。

［1］Zhao XH，Huang L.The characteristics of endothelial progenitor cell biology and its effects on the cardiovascular system［J］.Chin J Interven Card，2005，13（6）:405-407.［趙曉輝，黃嵐.內皮祖細胞生物學特性及其在心血管系統中的作用［J］.中國介入心臟病學雜志，2005，13（6）:405-407］.

［2］Cegla J，Troke RC，Jones B，et al.Co-infusion of low-dose glucagon-like peptide-1（GLP-1）and glucagon in man results in a reduction in food intake［J］.Diabetes，2014，63（11）:3711-3720.

［3］Dalb?ge LS，Almholt DL，Neerup TS，et al.The novel GLP-1-gastrin dual agonist ZP3022 improves glucose homeostasis and increases β-cell mass without affecting islet number in db/db mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2014，350（2）:353-356.

［4］Wuchter P，Leinweber C，Saffrich R，et al.Plerixafor induces the rapid and transient release of stromal cell-derived factor-1 alpha from human mesenchymal stromal cells and influences the migration behavior of human hematopoietic progenitor cells［J］.Cell Tissue Res，2014，355（2）:315-326.

［5］Masyuk M，Abduelmula A，Morosan-Puopolo G，et al.Retrograde migration of pectoral girdle muscle precursors depends on CXCR4/ SDF-1 signaling［J］.Histochem Cell Biol，2014，142（5）:473-488.

［6］Liu F，Tang JZ，Zhu LY，et al.Induced VEGF in umbilical cord blood endothelial progenitor cells and the expression of SDF-1/CXCR4 GLP-1 gene［J］.Chin Modern Med J，2013，23:32-36.［劉峰，湯佳珍，朱凌燕，等.GLP-1基因誘導臍血內皮祖細胞VEGF和SDF-1/ CXCR4表達［J］.中國現代醫學雜志，2013，23:32-36］.

［7］Shin JW，Lee DW，Kim MJ，et al.Isolation of endothelial progenitor cells from cord blood and induction of differentiation by ex vivo expansion［J］.Yonsei Med J，2005，46（2）:260-267.

［8］Escalada FJ.The physiology of glucagon-like peptide-1 and its role in the pathophysiology of type 2 diabetes mellitus［J］.Med Clin （Barc），2014，143 Suppl 2:2-7.

［9］Kim HY，Hwang JI，Moon MJ，et al.A Novel long-acting glucagon-like peptide-1 agonist with improved efficacy in insulin secretion and βcell growth［J］.Endocrinol Metab（Seoul），2014，29（3）:320-327.

［10］Raz O，Lev DL，Battler A，et al.Pathways mediating the interaction between endothelial progenitor cells（EPCs）and platelets［J］.PLoS One，2014，9（6）:e95156.

［11］Takeda Y，Amano A，Noma A，et al.Systems analysis of GLP-1 receptor signaling in pancreatic β-cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2011，301（4）:C792-803.

［12］Zhan Y，Sun HL，Chen H，et al.Glucagon-like peptide-1（GLP-1）protects vascular endothelial cells against advanced glycation end products（AGEs）-induced apoptosis［J］.Med Sci Monit，2012，18（7）: BR286-291.

［13］Kimura R，Okouchi M，Fujioka H，et al.Glucagon-like peptide-1 （GLP-1）protects against methylglyoxal-induced PC12 cell apoptosis through the PI3K/Akt/mTOR/GCLc/redox signaling pathway［J］.Neuroscience，2009，162（4）:1212-1219.

［14］Zhao QH，Wang SG，Liu SX，et al.PPARγ forms a bridge between DNA methylation and histone acetylation at the C/EBPα gene promoter to regulate the balance between osteogenesis and adipogenesis of bone marrow stromal cells［J］.FEBS J，2013，280（22）:5801-5814.

［15］Ardi VC，Alexander LD，Johnson VA，et al.Macrocycles that inhibit the binding between heat shock protein 90 and TPR-containing proteins［J］.ACS Chem Biol，2011，6（12）:1357-1366.

［16］Hattori K，Heissig B，Tashiro K，et al.Plasma elevation of stromal cell derived factor-1 induces mobilization of mature and immature hematopoietic progenitor cells［J］.Blood，2001，97（11）:3354-3360.

［17］Hu TH，Yao Y，Yu S，et al.SDF-1/CXCR4 promotes epithelialmesenchymal transition and progression of colorectal cancer by activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway［J］.Cancer Lett，2014，354（2）:417-426.

（2014-11-03收稿 2015-01-05修回）

（本文編輯 陳麗潔）

GLP-1 regulates proliferation，differentiation and apoptosis of endothelial progenitor cells isolated from human umbilical cord blood by targeting the SDF-1/CXCR4 signaling pathway

LIU Feng1，XU Wenqiong1，MIN Na2，TANG Jiazhen1，HUANG Haihua1
1 Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2 The Third Affiliated Hospital of Nanchang University

Objective To investigate the molecular regulatory mechanism of glucagon like peptide 1（GLP-1）on proliferation，differentiation and apoptosis of human umbilical cord blood endothelial progenitor cells（EPCs）.Methods EPCs were isolated from the umbilical cord blood of healthy pregnant women and cultured in 6-hole cell plate at 2×105 density in vitro，transfected with empty vector plasmid（control group），pcDNA3-GLP-1 plasmid（GLP-1 group），pcDNA3-GLP-1plasmid+AMD3100（GLP-1+AMD3100 group）and simple AMD3100（AMD3100 group）.The pcDNA3-GLP-1 was transfected into EPCs.The 25μmol/L AMD3100 was used to block the SDF-1/CXCR4 signal pathway of EPCs for 1 h.The cell proliferation was determined by MTT method.The mRNA expressions of differentiation and apoptosis related genes PPARγ，C/EBPα and Caspase-3 were investigated by RT-PCR，and Caspase-3 activity was determined by Caspase-3 activity assay kit.Results Compared to control group，AMD3100 inhibitor showed no effects on cell proliferation，differentiation and apoptosis，while over-expression of GLP-1 in EPCs obviously promoted cell proliferation，and differentiation related genes PPARγ and C/EBPα mRNA expression，but down-regulated mRNA expression and the activity of Caspase-3 significantly（P＜0.05），indicating that GLP-1 increased proliferation and differentiation of EPCs while decreased cell apoptosis.When the SDF-1/CXCR4 signaling pathway was blocked by AMD3100，over-expression of GLP-1 induced promotion of cell proliferation，and the differentiation was decreased significantly and the apoptosis was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion These data confirm that GLP-1 might promote EPCs proliferation and differentiation，and inhibit cell apoptosis through the regulation of the SDF-1/CXCR4 signaling pathway.

glucagon-like peptide 1；fetal blood；Caspase 3；cell proliferation；cell differentiation；apoptosis；endothelial progenitor cells；SDF-1/CXCR4；signaling pathway

R349.54

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.003

江西省自然青年基金（20114BAB215004）

1南昌大學第一附屬醫院內分泌科（郵編330006）；2南昌大學第三附屬醫院

劉峰（1980），男，副主任醫師，博士，主要從事糖尿病及其并發癥方面的研究