干擾素-γ對黑色素瘤細胞血管生成擬態的影響及機制

韓健，孫保存△，馬躍美，趙秀蘭

干擾素-γ對黑色素瘤細胞血管生成擬態的影響及機制

韓健1，孫保存1△，馬躍美2，趙秀蘭1

目的 研究干擾素-γ（IFN-γ）對人黑色素瘤細胞系MUM-2B遷移、侵襲和血管生成擬態（VM）形成能力的影響。方法 將MUM-2B細胞體外培養后分為3組：對照組在含10%FBS的DMEM培養基中培養；實驗1組另加入10 μg/L IFN-γ；實驗2組另加入100 μg/L IFN-γ。利用劃痕實驗和侵襲實驗分析IFN-γ對MUM-2B細胞遷移、侵襲能力的影響，三維培養觀察IFN-γ對MUM-2B細胞VM形成能力的影響，Western blot檢測MUM-2B細胞中血管內皮生長因子（VEGF）表達的變化。結果 劃痕實驗示實驗組細胞遷移距離低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05）；侵襲實驗示實驗組細胞侵襲數量低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05）；三維培養示對照組細胞能夠形成VM管道結構，實驗組細胞不能形成明顯的VM管道結構；Western blot示實驗組細胞中VEGF蛋白表達量低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05）。結論 IFN-γ可以在體外抑制MUM-2B細胞的遷移和侵襲，并通過抑制VEGF的表達而抑制其VM的形成。

黑色素瘤；干擾素γ，重組；血管內皮生長因子類；腫瘤干細胞；血管生成擬態

黑色素瘤是侵襲性最強的皮膚腫瘤［1］，轉移性黑色素瘤的預后很差，平均生存期只有4～6個月［2］。腫瘤血管生成是腫瘤細胞生長和轉移的重要條件。與傳統的內皮依賴性血管不同，血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）是由腫瘤細胞通過自身塑形構成的一種功能性微循環管道，可以為腫瘤組織輸送血液和營養物質，并有利于腫瘤的侵襲和轉移［3］。由于VM的存在，單純針對內皮細胞的抗血管生成治療效果往往不理想［4-5］，這提示在抗腫瘤血管生成治療中需要同時兼顧內皮依賴性血管與VM才有可能獲得良好的療效。研究顯示干擾素-γ（interferongamma，IFN-γ）能夠抑制腫瘤的侵襲和轉移［6］，但其對腫瘤VM形成是否有影響尚不明確。本文旨在研究IFN-γ在體外對人黑色素瘤MUM-2B細胞VM形成能力的影響，探討其可能的作用機制，為腫瘤抗血管生成治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤細胞系MUM-2B保存于天津醫科大學病理學實驗室；重組人IFN-γ購于Peprotech公司；DMEM細胞培養基、胎牛血清（FBS）購于Hyclone公司；Matrigel基質購自BD公司；兔抗人血管內皮生長因子（VEGF）抗體、兔抗人β-actin抗體購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組 MUM-2B細胞接種于含10%FBS、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的細培養箱中孵育培養，待細胞生長融合至90%時傳代培養，用于后續實驗。將細胞分為3組：對照組在含10%FBS的DMEM培養基中培養；實驗1組在含10%FBS的DMEM培養基中加入10 μg/L IFN-γ；實驗2組在含10%FBS的DMEM培養基中加入100 μg/L IFN-γ。

1.2.2 細胞劃痕實驗 將3組MUM-2B細胞接種于24孔板中，待細胞生長融合至90%后，棄掉培養基，在細胞表面進行劃痕，PBS清洗游離細胞，加入無血清培養基，以此時間點記為0 h。選取任意5個視野，于倒置顯微鏡下觀察細胞從劃痕邊緣向劃痕中央遷移的距離，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h拍照測量細胞遷移距離。實驗重復3次。

1.2.3 Transwell細胞侵襲實驗 將Matrigel膠以1.5 g/L的終濃度加入上層濾過小室（8 μm直徑小孔）表面；無血清培養液溶解的200 μL細胞懸液（5×105個/mL）加入上層小室，300 μL含20%FBS的培養基加入下層小室。37℃、5%CO2培養箱培養24 h，透膜細胞用冷甲醛固定并用0.5%的結晶紫染色。倒置顯微鏡觀察并計數。實驗重復3次。

1.2.4 三維培養 將4℃預處理的Matrigel膠與DMEM培養基1∶1混勻后加入96孔板中，50 μL/孔（冰上操作）；將96孔板置于37℃溫箱中，待膠凝固后，將3組MUM-2B細胞濃度調整為1×105個/mL，每孔加入細胞懸液100 μL，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育培養。定時于倒置顯微鏡下觀察細胞形成VM管道結構的能力。

1.2.5 Western blot檢測 實驗1組和實驗2組加入不同濃度IFN-γ處理24 h后，與對照組同時裂解細胞，提取總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原，加入一抗VEGF（1∶200）、β-actin （1∶1 000），4℃搖床過夜。次日取出PVDF膜，TBST漂洗3遍，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3遍。化學發光法（ECL）顯影、定影并拍照。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，3組間數據比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN-γ對MUM-2B細胞遷移能力的影響 對細胞進行劃痕后的0～12 h，3組細胞遷移距離差異無統計學意義，24 h后，實驗1組和實驗2組細胞遷移距離均低于對照組，實驗2組細胞遷移距離低于實驗1組（F=1 756.524，P＜0.05），見圖1、2。

Fig.1 Migration distances of cells in three groups圖1 3組細胞遷移距離（×40）

Fig.2 Comparison of migration distances of cells at different time points between three groups圖2 不同時間點3組細胞遷移距離比較

2.2 IFN-γ對MUM-2B細胞侵襲能力的影響 加入IFN-γ 24 h后，實驗1組和實驗2組細胞侵襲數量均低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05），見圖3、4。

2.3 IFN-γ對MUM-2B細胞體外VM管道形成能力的影響 三維培養24 h后，對照組MUM-2B細胞可形成管腔平滑、結構完整的管道樣結構，實驗1組和實驗2組細胞均不能形成明顯的管道樣結構，見圖5；且隨著濃度的增加，IFN-γ對MUM-2B細胞管道形成的抑制作用增強。

Fig.4 Comparison of invaded cell numbers between three groups圖4 3組24后細胞侵襲數量比較

2.4 IFN-γ對MUM-2B細胞VEGF蛋白表達水平的影響 加入IFN-γ 24 h后，實驗1組和實驗2組的細胞VEGF蛋白表達量均低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05），見圖6、7。

Fig.6 VEGF protein expressions of cells in three groups圖6 3組24 h后細胞VEGF蛋白表達水平

Fig.7 Comparison of VEGF protein expressions of cells between three groups圖7 3組24 h后細胞VEGF蛋白表達水平比較

3 討論

腫瘤的生長和轉移被認為是一個依賴于血管生成的過程。Maniotis等［7］在研究高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤微循環時發現并提出了一種全新的腫瘤血管生成模式，即VM，這種模式下惡性腫瘤細胞可以通過自身塑形和基質重塑而形成一種無內皮細胞襯覆、僅僅由腫瘤細胞和細胞外基質構成的微循環管道，血液可在其中流動。研究顯示VM能夠為腫瘤組織提供氧分和營養物質，其與內皮依賴性血管之間的連接可促進腫瘤細胞的血道播散，因此，VM的存在預示著腫瘤具有更高的侵襲性和轉移性，以及更差的預后［3］。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新和多向分化潛能的細胞群［8］。能夠形成VM的高侵襲性黑色素瘤細胞高表達與干細胞相關的基因，當新生血管的血液供應不足以滿足腫瘤的生長需要時，CD133表達陽性的腫瘤細胞可以模擬內皮細胞的功能并參與VM形成，提示CSCs可以向內皮細胞方向分化，在腫瘤VM的形成中起重要作用，針對CSCs的靶向治療可以抑制腫瘤細胞VM的形成［9-10］。

IFN-γ是多功能細胞因子家族的成員，具有抗病毒、免疫調節及抗腫瘤特性［11］。研究報道IFN-γ可以抑制腫瘤的侵襲和轉移，將IFN-γ基因轉入小鼠黑色素瘤細胞系B-16后，可有效抑制B-16細胞的生長［6，12］。本研究顯示IFN-γ能夠在體外抑制人黑色素瘤細胞系MUM-2B的侵襲和遷移能力，與既往報道相符［6］，且抑制作用隨著IFN-γ濃度的增加而增強，呈劑量依賴性。本研究通過三維培養進一步觀察IFN-γ在體外對MUM-2B細胞VM管道形成能力的影響，結果顯示IFN-γ能夠抑制MUM-2B細胞的管道形成能力，并呈劑量依賴性。上述結果提示100 μg/L的IFN-γ對MUM-2B細胞的侵襲、遷移和VM管道形成能力的抑制作用更強。有研究報道IFN-γ能夠通過激活吲哚胺2，3-加雙氧酶（IDO）而抑制間充質干細胞和神經干細胞的增殖和分化，并可誘導或增強間充質干細胞抑制因子的產生［13-14］，因此推測IFN-γ對MUM-2B細胞VM的抑制作用是通過對CSCs的影響而實現的。

VEGF不僅是重要的血管生成因子，還可以促進CSCs向內皮細胞方向分化。研究報道VEGF可以通過VEGFR-2/STAT3通路促進CSCs的自我更新，并能通過激活PI3K/Akt通路在體外促進大鼠干細胞向內皮細胞方向分化，抑制VEGF的表達后，C6神經膠質瘤干細胞的增殖和侵襲能力下降［15-17］，提示VEGF對CSCs的生長和分化具有促進作用，抑制VEGF的表達可以抑制CSCs向內皮細胞方向分化。本研究通過Western blot檢測了IFN-γ對MUM-2B細胞VEGF表達的影響，結果顯示IFN-γ能夠在蛋白水平抑制MUM-2B細胞VEGF的表達，并呈劑量依賴性，與其對MUM-2B細胞VM管道形成能力的抑制作用相一致，提示IFN-γ可能通過抑制VEGF的表達從而抑制了MUM-2B細胞中CSCs向血管內皮細胞方向的分化，最終抑制了VM的形成。

綜上，IFN-γ可以在體外抑制人黑色素瘤MUM-2B細胞VM的形成，其機制可能是通過抑制腫瘤細胞VEGF的表達進而抑制CSCs向血管內皮細胞方向分化而實現的，提示IFN-γ可以作為潛在的抑制劑對VM這一腫瘤生長早期血液供應的主要來源進行干預，為腫瘤的臨床治療提供了新的思路。

（圖3、5見插頁）

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（2014-12-10收稿 2015-01-25修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects and mechanism of interferon-gamma on vasculogenic mimicry of melanoma cells

HAN Jian1，SUN Baocun1△，MA Yuemei2，ZHAO Xiulan1
1 Department of Pathology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Surgery，Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail:sunbaocun@aliyun.com

Objective To investigate the effects of interferon-gamma（IFN-γ）on migration，invasion and vasculogenic mimicry（VM）formation of human melanoma cell line MUM-2B.Methods MUM-2B cells were divided into three groups，control group（10%FBS in DMEM），treatment group1（10 μg/L IFN-γ）and treatment group2（100 μg/L IFN-γ）.Different concentrations of IFN-γ were added in the culture medium of MUM-2B cells.Wound-healing assay and matrigel invasion assay were performed to examine the migration and invasion ability of MUM-2B cells.Three-D culture was used to observe the VM formation.The expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）of MUM-2B cells was detected by Western blot assay.Results The result of wound-healing assay showed that the migration distance of cells was decreased in treatment groups compared with that of control group.The migration distance of cells was decreased in treatment group2 compared with that of treatment group 1（P＜0.05）.The result of matrigel invasion assay showed that the number of invaded cells was decreased in treatment groups compared with that of control group，and which was significantly decreased in treatment group2 than that of treatment group1（P＜0.05）.The result of 3-D culture showed that cells in control group can form typical VM tube-like structures，whereas cells in treatment groups cannot.Western blot assay showed that the expression of VEGF protein was significantly decreased in treatment groups compared with that of control group，and the expression of VEGF protein was significantly decreased in treatment group2 than that of treatment group 1（P＜0.05）.Conclusion These data suggest that IFN-γ inhibits migration and invasion of MUM-2B cells，and inhibits VM formation by down regulating VEGF expression in vitro.

melanoma；interferon-gamma，recombinant；vascular endothelial growth factors；cancer stem cells；vasculogenic mimicry

R739.5

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.002

國家自然科學基金重點項目（81230050）；天津市科委重點項目（10JCZDJC20400）

1天津醫科大學病理學教研室（郵編300070）；2天津醫科大學外科手術學教研室

韓健（1983），男，助理實驗師，碩士在讀，主要從事腫瘤病理學研究

△E-mail：sunbaocun@aliyun.com