肝移植術后急性排斥患者血清的蛋白質組學分析

蔣琪，茹雅維，李克秋，李光

肝移植術后急性排斥患者血清的蛋白質組學分析

蔣琪，茹雅維，李克秋，李光△

目的 尋找與肝移植術后急性細胞排斥反應（ACR）相關的血清蛋白標志物，并初探相應機制。方法 收集3例經肝移植手術、病理證實ACR患者血清為ACR組；3例肝移植術后、肝功能各項指標達到臨床正常值，預后良好患者血清為No-ACR組；6例健康體檢者血清等量混合后取出2份為Control組。應用蛋白質組學相關技術對血清蛋白質組進行分離，同位素標記相對與絕對定量（iTRAQ）技術篩選和鑒定出3組間的差異表達蛋白，并應用KEGG和STRING軟件對其進行功能分析。結果 在ACR組與Control組間檢出88個差異表達蛋白，No-ACR組與Control組間檢出39個，ACR組與No-ACR組間檢出10個；對比88個和10個差異表達蛋白，共同存在的有9個。88個差異表達蛋白中30個之間有直接的相互作用，并可被定位于軟件中的13個信號通路，其中14個（46.67%）分布在補體和凝血級聯反應通路；No-ACR組與Control組檢出的39個差異表達蛋白中10個有直接相互作用，其中9個集中在補體和凝血級聯反應通路。結論 應用蛋白質組學技術鑒定出的9種與ACR關系密切的差異表達蛋白，可作為開發ACR早期診斷標志物的候選蛋白；補體和凝血級聯反應通路在肝移植術后被顯著調節，預示與ACR的發生密切相關。

肝移植；血清；生物學標記；急性細胞排斥反應；蛋白標志物；同位素相對標記與絕對定量技術

自1963年Starzl首度將肝移植（liver transplantation，LT）技術應用于臨床以來，歷經半個世紀的發展，目前肝移植已成為治療各種終末期肝病唯一有效的方法［1］。急性細胞排斥反應（acute cellular rejection，ACR）不僅是早期移植物失功的一個重要原因，而且也會影響移植物的長期存活。而如今由于強效免疫抑制劑的應用，臨床ACR發生率明顯降低，且發生ACR的臨床癥狀、體征缺乏典型性，肝移植術后肝臟的一些其他病變和排斥反應的病理學表現重疊存在，使其早期診斷變得越發困難［2-4］。蛋白質組學具有高通量、高靈敏度、高效率的特性，已在多種重大疾病研究中發揮了重要作用，但在器官移植后輔助診斷排斥或耐受相關生物標志物領域應用較少［5-6］。本研究應用蛋白質組學及生物信息學技術對ACR、No-ACR患者及健康體檢者的血清進行定量、篩選和鑒定，尋找與肝移植術后ACR相關的血清特異性表達標志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 ACR組和No-ACR組血清來自天津市第一中心醫院2013年1月—2014年12月行肝移植手術治療的患者。經手術、病理學檢查證實的ACR患者3例，男性，年齡42～65歲；肝移植術后、肝功能各項指標達到臨床正常值、預后良好的No-ACR患者3例，男性，年齡37～63歲；同期選取健康體檢者6例，男性，年齡35～65歲，為健康對照組（Control組）。

1.1.2 試劑 尿素（分析純）為Gibco BRL公司產品；乙二胺四乙酸（EDTA，超純）、苯甲基磺酰氟（PMSF，超純）、考馬斯亮藍染料G250（超純）、過硫酸胺（化學純）購自Amesco公司；二硫素糖醇（DTT，化學純）、碘乙酰胺（IAM，化學純）購自Promega公司；丙烯酰胺（化學純）、SDS（化學純）、N，N，N′，N′-四甲基乙烯二胺（TEMED，分析純）、溴酚藍（分析純）購自購自SIGMA公司；乙醇（分析純）、乙酸（分析純）、甲酸（質譜純）購自北京化工廠；乙腈（質譜純）、甲醇（質譜純）購自Fisher Scientific公司；iTRAQ?Reagent-8Plex Multiplex Kit購自Applied Biosystem；strata-X C18除鹽柱、SCX強陽離子交換柱Luna SCX 100A購自Phenomenex公司。雙蒸水為華大蛋白實驗室用MilliQ純水儀制備。

1.1.3 儀器 島津常規液相，戴安納升液相，Thermo fisher Q-Exactive質譜儀，布魯克 Ultra flex，UMAX Power look 2100XL-USB掃描儀，IKA振蕩器，Tanon電泳槽，DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）；恒溫加熱塊（鼎國昌盛生物技術有限公司）；離心機（eppendorf centrifuge 5417R型）；LX-100手掌式離心機（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋（長安科學儀器）；數據采集軟件：Thermo fisher Proteome Discoverer 1.3；Mascot版本：2.3.0。

1.2 方法

1.2.1 血清收集 取3組研究對象清晨空腹肘正中靜脈血3 mL。ACR患者在排斥期抽取；No-ACR患者在術后半年內抽取；Control組在體檢時留取。于4℃放置60 min，2 000 r/min離心30 min，吸取血清，分裝，于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 同位素標記相對與絕對定量（isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ）實驗 為減少個體差異將Control組6個血清各取200 μL混合。分別在ACR組（3個）、No-ACR組（3個）、Control組（2個）各取250 μL，ProteoMiner去除血清中高豐度蛋白，提取蛋白質，使用Bradford法測量蛋白濃度。用胰酶消化蛋白質至肽段水平，使用iTRAQ試劑分別對8個樣本進行標記（113～119、121），SCX分離肽段后進行質譜檢測。

1.2.3 差異表達蛋白篩選 根據質譜檢測數據，用Isobar軟件對鑒定出的蛋白質進行相對定量分析，從而篩選出差異表達蛋白。設定的差異表達蛋白的定義標準是：（1）每個蛋白質擁有2個以上唯一肽段數（unique peptides）或者單一unique peptide具有兩個以上譜圖數。（2）2組中每份樣本分別進行兩兩比對，所得到的每個比值應變化方向一致。（3）平均比值大于1.2或者小于0.83。

1.2.4 生物學分析 利用KEGG和STRING軟件對篩選出的差異表達蛋白進行功能分析。

2 結果

2.1 ACR相關蛋白標志物的篩選 在ACR組與Control組之間篩選出88個差異表達蛋白，其中上調蛋白36個，下調蛋白52個；在No-ACR組與Control組之間篩選出39個差異表達蛋白，其中上調蛋白17個，下調蛋白22個；在ACR組與No-ACR組之間篩選出10個差異表達蛋白，其中上調蛋白3個，下調蛋白7個，見表1。將ACR組和Control組之間篩選出的88個差異表達蛋白與表1中差異表達蛋白進行比較，發現共同存在的差異表達蛋白共9個，包括3個上調蛋白和6個下調蛋白，見圖1。這9種差異表達蛋白存在于2組差異表達蛋白的交集之中，即相對于健康人和預后良好患者而言，在ACR患者血清中他們的表達水平都發生了顯著改變，且變化趨勢一致，因此他們是理想的肝移植術后ACR相關蛋白標志物候選蛋白。

2.2 差異表達蛋白的功能分析 ACR組與Control組比較篩選到的88個差異表達蛋白中有30個蛋白質之間具有直接的相互作用，并可以被定位于軟件中的13個信號通路：神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、溶酶體（Lysosome）、補體和凝血級聯反應（Complement and coagulation cascades）、蛋白質消化和吸收（Protein digestion and absorption）、ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）、趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway）、細胞因子-細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、肌動蛋白細胞骨架的調控（Regulation of actin cytoskeleton）、黏著斑（Focal adhesion）、非洲錐蟲病（African trypanosomiasis）、系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus infection）和阿米巴疾病（Amoebiasis）。其中14個差異表達蛋白分布在補體和凝血級聯反應（淺綠色表示）系統，占46.67%，見圖2。同理，在No-ACR組與Control組中鑒定到的39個差異表達蛋白中，10個有直接相互作用的差異表達蛋白9個集中在補體和凝血級聯反應（淺綠色表示）通路，占總數的90%，見圖3。

Tab.1 Comparison of differentially expressed proteins in serum between ACR group and No-ACR group after liver transplantation表1 肝移植后ACR組與No-ACR組比較血清中差異表達蛋白

Fig.1 Screening of differentially expressed proteins related with ACR圖1 ACR相關差異表達蛋白的篩選

3 討論

ACR通常發生于移植后早期，一般為6周以內，ACR的診斷通常要依靠病理學檢查，但由于穿刺活檢的有創性限制了其臨床應用，尋找可靠的診斷標志物可以幫助解決這一難題［4］。通常認為肝移植后ACR是細胞介導的免疫反應，但近年來研究發現，ACR階段的移植肝與移植心臟和移植腎一樣，組織內也有補體成分沉積［7］。體液免疫、細胞免疫及補體等多種免疫組分都參與ACR的發生。這些免疫組分通過血液循環在全身或局部發揮作用，因此血清中極有可能存在相關免疫成分，可以作為可靠的診斷標志物，協助早期診斷ACR［2，8-9］。補體系統作為機體最重要的非特異性免疫屏障，是構成免疫系統的重要組成部分。炎癥及組織損傷都可以激活補體系統。不僅可以由抗原抗體反應經典途徑激活，也可以由組織損傷碎片經旁路途徑激活［10-11］。有研究報道，補體系統激活后可引起肝移植術后排斥反應的發生，C4和C1q都是ACR的獨立預測標志物，C4的預測價值最高，他們都集中在補體經典通路中［12-13］。

本研究結果顯示，2組差異表達蛋白（ACR與Control、No-ACR與Control）均在補體和凝血級聯反應通路發生顯著變化，提示補體和凝血級聯反應通路在肝移植術后被強烈地激活或抑制，該通路的變化與肝移植術后免疫狀態的產生有密切的聯系。而且，圖1中有9個ACR候選蛋白標志物，其中補體因子H相關蛋白（CFHR）1和CFHR5在ACR組中表達呈顯著下調，他們在補體系統中發揮著重要的作用，因此筆者認為CFHR1和CFHR5可以作為進一步研究肝移植術后急性排斥相關機制的突破口，為誘導免疫耐受提供新的思路。

CFHR家族包括 5個血漿蛋白：CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5，屬于補體調節蛋白，這些蛋白都與中心補體成分C3b相連，對于補體旁路途徑的調節具有重要作用［14-15］。CFHR1可以與C5轉化酶的C3b成分結合，從而阻止末端通路。另外，CFHR1還可以與H因子競爭性結合C3b。因此，CFHR1的表達下調，會減弱對C5分裂的抑制作用［16］，不能及時抑制活化的補體系統，從而在某種程度上引發了ACR。CFHR5可以與H因子競爭性結合C3b，也能與C3b分裂產物iC3b結合。另外，CFHR5還與C反應蛋白（CRP）結合，通過CRP滅活C3b［16］。因此，CFHR5表達的降低也會引起補體調節系統的紊亂，與ACR的發生密切相關。

對表達下降的補體調節蛋白CFHR1和CFHR5進行深入的研究，將有利于進一步揭示肝移植術后急性排斥發生的分子機制。然而，要明確這兩個蛋白的功能及適用于臨床的檢測方法，為ACR的早期診斷和應用藥物靶向性治療提供可靠的理論依據，還需要擴大樣本量深入探究。

（圖2、3見插頁）

［1］Song AT，Avelino-Silva VI，Pecora RA，et al.Liver transplantation: fifty years of experience［J］.World J Gastroenterol，2014，20（18）: 5363-5374.doi:10.3748/wjg.v20.i18.5363.

［2］Rodriguez-Peralvarez M，Garcia-Caparros C，Tsochatzis E，et al.Lack of agreement for defining'clinical suspicion of rejection'in liver transplantation:a model to select candidates for liver biopsy［J］.TransplInt，2015，28（4）:455-464.doi:10.1111/tri.12514.

［3］Gehrau RC，Mas VR，Suh JL，et al.Liver transplant complications in hepatitis C infected recipients:recurrence versus rejection［J］.Expert Rev GastroenterolHepatol，2014，8（5）:453-456.doi:10.1586/ 17474124.2014.898562.

［4］de la Pe?a-Moral JM，Pons JA，Tome S，et al.Acute cellular rejection versus recurrent hepatitis C after liver transplantation:Clinical and pathological features driving a rational diagnostic approach［J］.Hepatol Res，2015，45（4）:423-431.doi:10.1111/hepr.12369.

［5］Germani G，Rodriguez-Castro K，Russo FP，et al.Markers of acute rejection and graft acceptance in liver transplantation［J］.World J Gastroenterol，2015，21（4）:1061- 1068.doi:10.3748/wjg.v21.i4.1061.

［6］Ren Z，Jiang J，Lu H，et al.Intestinal microbial variation may predict early acute rejection after liver transplantation in rats［J］.Transplantation，2014，98（8）:844-852.doi:10.1097/TP.0000000000000334.

［7］Dugum M，Askar M，Pai RK，et al.Re-examination of sinusoidal deposition of complement 4d in liver allografts:experience from a single institution［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（2）:784-791.

［8］Bentall A，Tyan DB，Sequeira F，et al.Antibody-mediated rejection despite inhibition of terminal complement［J］.TransplInt，2014，27 （12）:1235-1243.doi:10.1111/tri.12396.

［9］Shi YC，Sun YL，Liu ZW，et al.Characteristics of Tfh cells in the peripheral blood in recipients of liver allograft:A pilot study［J］.Med J Chin PLA，2014，39（12）:965-968.［石彥超，孫艷玲，劉振文，等.肝移植患者外周血Tfh細胞特征的初步研究［J］.解放軍醫學雜志，2014，39（12）:965-968］.

［10］Verhelst XP，Troisi RI，Colle I，et al.Biomarkers for the diagnosis of acute cellular rejection in liver transplant recipients:A review［J］.Hepatol Res，2013，43（2）:165-178.doi:10.1111/hepr.12012.

［11］Fossati-Jimack L，Ling GS，Baudino L，et al.Intranasal peptide-induced tolerance and linked suppression:consequences of complement deficiency［J］.Immunology，2015，144（1）:149-157.doi:10.1111/ imm.12358.

［12］Massoud O，Heimbach J，Viker K，et al.Noninvasive diagnosis of acute cellular rejection in liver transplant recipients:a proteomic signature validated by enzyme-linked immunosorbentassay［J］.Liver Transpl，2011，17（6）:723-732.doi:10.1002/lt.22266.

［13］Touzot M，Obada EN，Beaudreuil S，et al.Complement modulation in solid-organ transplantation［J］.Transplant Rev（Orlando），2014，28 （3）:119-125.doi:10.1016/j.trre.2014.03.001.

［14］Chen Q，Wiesener M，Eberhardt HU，et al.Complement factor H-related hybrid protein deregulates complement in dense deposit disease［J］.JClin Invest，2014，124（1）:145-155.doi:10.1172/ JCI71866.

［15］Skerka C，Chen Q，Fremeaux-Bacchi V，et al.Complement factor H related proteins（CFHRs）［J］.MolImmunol，2013，56（3）:170-180.doi:10.1016/j.molimm.2013.06.001.

［16］Jozsi M，Meri S.Factor H-related proteins［J］.Methods Mol Biol，2014，1100:225-236.doi:10.1007/978-1-62703-724-2_18.

（2015-02-11收稿 2015-03-11修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Proteomic analysis of the serum from patients with acute rejection after liver transplantation

JIANG Qi，RU Yawei，LI Keqiu，LI Guang△
Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail:heshengguang@hotmail.com

Objective To investigate the protein markers that specifically expressed in patients with acute rejection （ACR）after liver transplantation，and to explore preliminarily the mechanisms.Methods Serum samples from three patients with pathologically confirmed ACR after liver transplantation in Tianjin First Central Hospital were collected as ACR group.Three serum samples from patients with normal liver function indicators after liver transplantation were collected as No-ACR group.And six serum samples from healthy examination were mixed with equal amount as healthy control group.Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation（iTRAQ）was employed to separate，screen and identify the differentially expressed proteins between three groups.KEGG and STRING software were applied to deeply analyze the data of three groups.Results A total of 88 differentially expressed proteins were found between ACR group and healthy control group.There were 39 differentially expressed proteins between No-ACR group and healthy control group.Ten differentially expressed proteins were acquired between ACR group and No-ACR group.Comparing 88 and 10 differentially expressed proteins，9 proteins were the same.Among 88 differentially expressed proteins，30 of them showed a direct interaction，and can be positioned in 13 signaling pathways based on KEGG and STRING software.Fourteen（46.67%）of the 30 proteins were located in the complement and coagulation cascade pathway.Among 39 differentially expressed proteins，which were detected between No-ACR group and control group，10 proteins showed a direct interaction including 9 proteins concentrated in the complement and coagulation cascade pathway.Conclusion By proteomic analysis，nine differentially expressed proteins are obtained，which may be regarded as the candidate bio-markers for ACR early diagnosis after liver transplantation.The complement and coagulation cascades system is significantly adjusted after liver transplantation，indicating this pathway plays an important role in the occurrence of ACR.

liver transplantation；serum；biological markers；acute cellular rejection；protein biomarkers；isobaric tags for relative andabsolute quantitation

R392.4

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.001

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2012AA021003）；國家自然科學基金資助項目（21177091）；天津市科技計劃項目（12ZCZDSY03400）

天津醫科大學（郵編300070）

蔣琪（1985），女，碩士在讀，主要從事器官移植免疫耐受研究

△E-mail:heshengguang@hotmail.com