原發性膽汁性肝硬化免疫發病機制的研究進展

唐學良

河南省鄭州瑞龍醫院檢驗科，河南鄭州 450100

原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）是由于某種免疫介質傳遞不足，導致免疫調節功能紊亂發生免疫亢進的一種疾病，臨床典型表現為瘙癢和疲勞。患者常見皮膚抓痕、肝脾體積增大、黃疸等癥狀，但并不是特異性癥狀。黃疸的癥狀通常出現在PBC的晚期階段，但在早期PBC患者中也并不少見。根據臨產的PBC病發量統計，PBC每年的發病率大約為萬分之3.95，發病的患者大多數為女性（占83%左右），患者的平均年齡為（63.4±3.5）歲，臨床主要表現為四肢乏力和皮膚瘙癢[2]。PBC的特異性診斷指標為血清AMAs呈陽性，一般確診后平均存活年限為（15.6±1.8）年。雖然男性和女性PBC患者在血清學、組織學以及生物化學方面不存在本質差異，卻在病癥學方面有明顯區別，男性PBC患者出現亞種并發癥的可能性更高，肝癌和消化系統病變等并發癥都較為常見。相關資料指出，隨著PBC早期診斷技術的進步及熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)治療方法在臨床應用的逐漸推廣，有效地提高3PBC的臨床治療效果，但是仍有部分患者治療效果不理想，需接受肝移植手術。研究顯示，自身免疫特征、遺傳因素、外界環境是PBC發病機制中的重要誘因。該研究選取2011年3月—2013年3月該院收治的100例PBC患者作為研究對象，利用雙色熒光標記技術對所有血樣中的CD4+CD25+T細胞亞群和CD4+CD28+T細胞亞群的變化情況用流式細胞術進行觀察和檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究選取100例PBC患者作為對象根據他們病情的不同，分為PBC活動期組和PBC穩定期組，PBC活動期組患者65人，PBC穩定期患者35人。PBC活動期組中，男性20名，女性45名，年齡 36～81歲，平均年齡（58.4±14.2）歲；PBC 穩定期組中，男性 9名，女性 26名，年齡 34～82歲，平均年齡（57.8±15.7）歲。 這100名患者都符合2000年美國肝病學會制定的對PBC的診斷指導建議，且都不存在其他可能干擾實驗結果的肝臟疾病，如藥物性、酒精性肝病患者；肝內或肝外膽道梗阻、肝腫瘤等。同時，選擇同期的50名身體健康體檢者作為對照組，對照組中男性20名，女性 30 名，年齡 25～85 歲，平均年齡（53.9±16.3）歲。

1.2 方法

實驗要求所有參與實驗人員在實驗當日晨起后不得進食，然后抽取實驗對象的手肘靜脈血液作為樣本，并加入新鮮肝素鈉抗凝，然后將血樣送檢。然后，使用COULTER EPICS XL流式細胞儀檢測送檢的血樣。標準單克隆熒光抗體包括：FITC-CD4、PE-CD25、PE-CD28以及溶血素。將適量的雙色抗體（FITC-CD4/PE-CD25、FITC-CD4/PE-CD28）加入至送檢的血樣中，在避光、常溫的條件下，孵育血樣20 min，隨后將2 mL左右的紅細胞裂解溶液加入血樣中，利用OptimaTMXPN超速離心機以1200 r/min的速度進行5 min的離心操作，將離心后產生的上清液去除，加入2 mL左右的磷酸鹽緩沖液，繼續以1000 r/min的速度進行5 min的離心操作，再次將離心后產生的上清液去除，對以上過程進行再一次重復操作，隨后將500 μL磷酸鹽緩沖液加入兩次離心后的血樣中，最后檢測其結果。檢測的過程中，對于淋巴細胞門A，通過前向散色光和側向散色光進行鎖定，將各個通道間設置為補償自動調節，隨后觀察并記錄CD4+CD25+T細胞亞群和CD4+CD28+細胞亞群的變化情況。

1.3 統計方法

采用SPSS18.0統計軟件對以上數據進行統計學分析，計量方式使用均數±標準差（±s），組間比較采用 t檢驗。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

PBC活動期患者血液中的CD4+CD25+T細胞亞群占CD4+T細胞總量的比例相對于PBC穩定期患者和健康人群水平低，差異有統計學意義（P＜0.05），而CD4+CD28+細胞亞群占CD4+T細胞總量的比例相對于PBC穩定期患者和健康人群水平高，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時，PBC穩定期患者血液中的CD4+CD25+T細胞亞群占CD4+T細胞總量的比例相對于健康人群水平低，差異有統計學意義（P＜0.05），而 CD4+CD28+T細胞亞群占CD4+T細胞總量的比例相對于健康人群水平高，差異有統計學意義（P＜0.05）。以上結果說明PBC患者血液中的CD4+CD25+T細胞亞群和CD4+CD28+細胞亞群含量存在顯著的變化，見表1。

表1 PBC患者不同時期和健康人群血樣中兩種細胞亞群的含量對比（±s）

表1 PBC患者不同時期和健康人群血樣中兩種細胞亞群的含量對比（±s）

組別CD4+CD25+T細胞亞群 CD4+CD28+T細胞亞群PBC活動期組PBC穩定期組健康對照組1.70±0.762.41±0.894.32±1.124.350±1.313.67±0.881.35±0.89

3 討論

在20世紀90年代，因為PBC是一種會對肝臟造成比較嚴重的損害的疾病，其臨床癥狀和病毒性肝炎的癥狀存在很大的重合性，又因為我國一直乙肝肝病高發國家，所以當時的醫生在臨床診斷時無法對PBC病癥做出正確的判斷，常常被誤診為病毒性肝炎，從而嚴重耽誤了PBC疾病的治療，加重了患者的痛苦[3-4]。

20 世紀90年代之后，越來越多的醫生和基礎研究學者開始對PBC這種特殊的肝病給予了更多的關注和研究。在我國，一大批著名的風濕病、消化病、肝病專家，如李明宇、莊輝煌、張福強、邱德川、楊少偉、張鎮松、王吉耀、姚光弼、賈繼東等，他們在臨床治療的實踐過程中，觀察PBC這種疾病的發病原因和病情發展趨勢，從臨床診斷、病程觀測、藥物治療等方面入手，進行科學分析和研究，發表了不少文章，呼吁國內醫生和醫學研究人員加強對PBC疾病的重視，進一步對PBC的臨床和基礎進行探索和研究[5]。

事實上，目前對于PBC的確診方式并不復雜，特異性診斷指標為血清AMAs呈陽性，約90%的PBC患者都符合這一特性[6]。因此，只要醫院全面展開檢測病人血清AMAs這一項目，就可以使PBC的臨床確診變得方便而快捷。而少部分血清AMAs呈陰性的PBC病患，身體中其他免疫抗體會特異性地出現，比如核心蛋白p62抗體、核心蛋白gp210抗體、抗平滑肌抗體（SMA）、核纖層蛋白B受體（LBR）抗體等，這些抗體的存在同樣為PBC病癥的診斷提供了可靠的依據。此外，對于血清AMAs呈陰性的PBC患者的診斷，除了通過檢測以上免疫抗體外，還需要結合患者的臨床癥狀，必要時可以進行肝臟病理活檢。

對于PBC發病機制的研究，經歷了漫長而又艱難的過程。國外在過去的70多年間對PBC病癥的持續研究中，較為全面地了解了PBC的相關情況，然而這一可怕病癥依然存在很多未解之謎等待國內外醫學工作者和研究人員再進行深入的研究。例如：（1）PDC-E2作為抗原，普遍地存在于所有的人體細胞中，為什么PBC患者只針對BEC的PDC-E2產生免疫抗體；（2）BEC對于PDC-E2是否具有直接抗原遞呈作用；（3）為什么PBC破壞淋巴細胞存在自身抗原耐受性，其原理是什么；（4）為什么PBC病癥在女性人群的發病率遠遠高于男性，這一現象是否與X性染色體有直接關聯；（5）PBC在男性人群中的發病率相對女性明顯較低，是否與Y染色體存在直接關聯；（6）性激素在PBC的病情發展過程中起到了什么作用。以上這些問題都有待于醫學研究人員進行探索和研究，通過大量的臨床實驗進行驗證和解釋。

PBC作為一種免疫介質傳遞不足，導致免疫調節功能紊亂發生免疫亢進、肝內膽小管進行性增生和非膿性炎癥作為主要特征的慢性膽汁性淤積性疾病[7]。臨床研究顯示，PBC患者在自身的免疫平衡系統受到破壞后，機體本身抗原物質耐受能力變差，從而導致肝內中小型膽管受到持續攻擊，引起破壞性膽汁淤積及肝膽炎癥[8]。CD4+CD25+T細胞亞群是一種專職抑制性細胞，具有特殊免疫調節作用：通過細胞間接觸進而抑制NK細胞和CD28+細胞等人體自身反應細胞所產生細胞毒作用。另一方面，CD4+CD28+T細胞亞群具有促使Th1和Th2細胞調節失衡的效果，從而使得以Th1細胞因子為主的免疫反應進入肝臟損害過程。該次試驗顯示，PBC活動期患者血清CD4+CD25+T含量明顯低于PBC穩定期患者和健康人群，而CD4+CD28+細胞亞群含量則相對較高,結合以上結果及相關臨床資料，該次研究認為PBC患者疾病的發展同患者機體CD4+CD28+、CD4+CD25+T細胞亞群失調引起患者免疫系統功能紊亂之間存在密切關系，其具體作用機制有待于進一步深入研究。

綜上所述，CD4+CD25+T含量在PBC患者血液中的減少，打破了效應T細胞亞群和調節性T細胞亞群之間的動態平衡關系，患者維持自身免疫應答的穩態遭到破壞，最終引發PBC病癥。

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