豬傳染性胃腸炎病毒結構蛋白及疫苗的研究進展

謝 偉 ，程 洋 ，張 勇 ，文水英 ，張德勇 ，馬永梅

（1.四川省樂山市沙灣區動物疫病預防控制中心，四川 樂山 614900；2.四川省樂山市沙灣區譚壩鄉畜牧獸醫站，四川 樂山 614903；3.四川省樂山市沙灣區嘉農鎮畜牧獸醫站，四川 樂山 614902）

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒科，是引起仔豬腸道疾病的重要病原之一，以急性腹瀉、嘔吐、脫水為臨床癥狀，可致2周齡內的仔豬100%死亡[1]。目前該病無特效治療藥物，接種有效的豬傳染性胃腸炎疫苗是預防本病的主要手段。

1 TGEV結構蛋白

TGEV為有囊膜病毒，基因組為單股正鏈具有感染性的RNA，全長約28.5kb，分子量為6×103ku[2]。TGEV全基因組分為7個區，每個區包含1個或多個開放閱讀框（ORF），整個基因組結構順序為5′1a-1b-S-3a-3b-sM-M-N-3′，其中基因 S、sM、M、N 編碼TGEV的四種結構蛋白，即纖突蛋白（S）、核蛋白（N）、膜結合蛋白（M）和小膜蛋白（sM），這4種結構蛋白及其在病毒粒子中的功能各有特點。

1.1 S蛋白 纖突蛋白（S）為糖蛋白，具有花瓣狀囊膜突起，突出于病毒粒子表面。編碼S蛋白的S基因全長約4350bp，最初合成的S蛋白前體由1447或1449個氨基酸殘基組成，經切除信號肽和終末糖基化而成熟，分子量約195～220ku，是TGEV結構蛋白中最大的蛋白。S蛋白攜帶的B淋巴細胞抗原決定簇是誘導機體產生中和抗體和提供免疫保護的主要結構蛋白，在TGEV免疫保護方面發揮主導作用[3]。

1.2 N蛋白 N蛋白是一種磷酸化的酸性蛋白，并以螺旋式結構圍繞RNA存在于病毒粒子內部，是病毒核衣殼形成螺旋形結構的基礎。編碼N蛋白的N基因長約1700bp，分子質量約為45kD，編碼382個氨基酸，氨基酸殘基纏繞在一起，纏繞程度與絲氨酸的專一磷酸化有關[4]。N蛋白具有A、B、C三個高度保守的抗原區域，在誘導產生細胞免疫應答中起著重要作用[5]。

1.3 M蛋白 M蛋白是一種膜蛋白，在冠狀病毒中含量最多，是病毒粒子裝配的必需成分。編碼M蛋白的M基因全長約2600bp，編碼262個氨基酸殘基的M蛋白前體，切掉其N末端17個氨基酸殘基信號肽而成熟，分子質量約為29～31ku，連接1條富含甘露糖天冬酰胺的側鏈。M蛋白的6～22氨基酸殘基區有一干擾素基因決定簇，可以幫助TGEV誘導產生干擾素，TGEV感染的仔豬血液和腸道中可檢測出高水平的IFN-α[6]。用M蛋白制備的特異性單克隆抗體能有效地阻斷IFN-α干擾素的合成，而S、N蛋白的特異性單克隆抗體無此作用，提示在宿主抵抗病毒感染過程中M蛋白發揮了重要作用。

1.4 sM蛋白 sM結構蛋白是一種較小的膜結合蛋白，抗原位點位于C末端。編碼sM蛋白的基因全長約249 bp，編碼82個氨基酸，分子質量約78 ku，多肽掃描技術發現64-AYKNF-68殘基是誘導產生抗sM單克隆抗體的核心序列。Baudou等[7]研究發現，TGEV M蛋白和sM蛋白共表達是病毒樣顆粒組裝和釋放的必要條件，而且M蛋白與sM蛋白形成的VLPs能夠誘導IFN-α產生，可抵御TGEV的感染。

2 疫苗研究

TGEV疫苗大致經歷了4個階段，即人工感染強毒、滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

2.1 人工感染強毒 人工感染強毒是將發病豬的內臟或排泄物（含有強毒）摻入飼料飼喂，感染全場成年豬，尤其是妊娠后期母豬，使之產生免疫力，通過初乳保護仔豬。該方法雖然使仔豬獲得了一定的保護，但易造成場地等環境污染，且母豬抵抗力降低后易繼發感染其他疫病，導致強毒持續存在，不利于對該病原的消滅和控制，該方法現已被疫苗取代。

2.2 滅活疫苗 TGEV滅活疫苗分為組織滅活苗和細胞滅活苗。曹軍平等[8]采集急性發病且具有典型癥狀的病豬空腸（包括腸內容物）及腸系膜淋巴結，通過凍融、滅活、乳化制成組織滅活苗，經實驗室和野外試驗證實該苗安全可靠、保護率較高。賈華強[9]利用分離的TB株制成滅活細胞苗在4個流行TGE的豬場進行試驗，結果顯示免疫母豬所產仔豬在斷乳時的死亡率平均是8.5%，表明TGE細胞滅活苗具有較好的保護率。滅活疫苗雖然具有一定的保護率，也可以解決場地污染問題，但其只能通過注射免疫，誘導免疫應答較慢，不能刺激母豬產生有效的乳汁免疫，且制苗成本也比較高昂。

2.3 弱毒疫苗 TGEV弱毒疫苗毒株主要有美國的TGE-Vac株、匈牙利的CKP株、日本的TO-163株以及我國的華泰株。華泰株是在原代胎豬腎細胞上經165次傳代致弱，并經過5次克隆純化篩選而得。弱毒苗不宜在腸黏膜上皮細胞上吸附增殖，對腸黏膜的刺激較弱，因此乳汁中主要是IgG抗體，分泌型IgA較少，這是長期認為弱毒疫苗免疫效果不理想的主要原因。弱毒疫苗的免疫原性雖然優于滅活疫苗，但存在潛伏感染、排毒散毒、毒力返祖等缺陷。

2.4 基因工程疫苗 傳統疫苗雖然在預防TGE上有一定的效果，但在某種程度上存在不可避免的缺陷。隨著對TGEV分子生物學研究的深入，TGEV基因工程疫苗的研究取得了較快發展。

2.4.1 亞單位疫苗 亞單位疫苗可分為生物合成亞單位疫苗和重組抗原表位亞單位疫苗。生物合成亞單位疫苗是把保護性抗原基因導入細胞或受體菌，將其高效表達產物加以適合的佐劑乳化而制成。秦志華等[10]將S基因上A、B、C、D四個位點進行RT-PCR擴增，構建重組質粒pET30a-S，將純化的蛋白免疫小鼠可誘導產生特異性的體液免疫。用抗原表位氨基酸序列制備的疫苗稱為重組抗原表位亞單位疫苗。亞單位疫苗安全性高、副作用小，但免疫原性沒有全病毒的好，產生的中和抗體水平低。因此，開發出增強亞單位疫苗免疫原性的佐劑已成為研究熱點。

2.4.2 核酸疫苗 又稱基因疫苗，是將編碼某種抗原蛋白的外源基因克隆到真核質粒表達載體上并導入動物體細胞內，通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答。任曉峰等[11]在國內外首次構建了含有TGEV S基因的主要抗原位點（A、C、D）的SaPCI和含有TGEV完整S基因的SPCI兩種核酸疫苗，將這兩種重組核酸疫苗免疫小鼠后發現兩者都具有能激發機體產生保護性反應的免疫能力，但前者的免疫效果優于后者。宋振輝等[12]將TGEV的M和N結構蛋白基因分別克隆到FastBacTMDual載體，經轉化DH10Bac感受態細胞和轉染昆蟲細胞sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-M和rBac-N，通過口服免疫小鼠，結果顯示該重組桿狀病毒可誘導小鼠產生黏膜免疫和體液免疫應答。核酸疫苗具有易于制備、可塑性大、生產工藝簡單和成本低等優點，并可以同時構建編碼不同蛋白的重組質粒同時預防多種疫病。但核酸疫苗也有這樣一些問題，如外源目的基因選擇問題，載體和載體啟動子對外源基因表達有影響等。

2.4.3 轉基因植物疫苗 隨著植物高效基因載體系統和遺傳轉化技術的發展，利用轉基因植物生產動物基因工程疫苗用于防控動物疫病已成為當前研究的熱點。Gomez等[13]將TGEV的S基因克隆到花椰菜花葉病毒（CaMV35S）啟動子下游并轉染到擬南芥的種子中，成功構建了TGEV轉基因植物疫苗，用該植物飼喂生豬可產生中和抗體，具有免疫保護作用。Gomez等[14]將TGEV的S蛋白的N端結構域轉入到馬鈴薯中制成轉基因馬鈴薯，用其飼喂小鼠可產生抗S蛋白的特異性血清抗體。目前，TGEV的S基因已被轉入馬鈴薯、煙草、紅豆花葉、擬南芥、玉米等植物中，并進行了相關的動物實驗，部分已檢出相應抗體，表明TGEV轉基因植物疫苗有廣闊的發展前景。

3 結語

近年來，隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發展，對TGEV基因組結構、結構蛋白和基因工程苗等方面的研究已取得了較大的進展，但對非結構蛋白的結構和功能、抗TGEV感染的保護性免疫機制、毒株間的變異對致病性的影響等還有待于深入研究。此外，由于疫苗生產技術等因素的影響，傳統疫苗在市場上仍占有較大的比例，改進工藝、研究免疫原性好的菌（毒）株，尤其是基因工程疫苗，將是今后疫苗研究的一個重要方向。

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