微小RNAs在破骨細胞分化調控中的研究進展

連俊翔 杜瑋 孟姝

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院牙周病科（四川大學），成都 610041

牙槽骨是骨骼系統中代謝改建最活躍的部分，正常情況下其吸收與新生維持在平衡狀態。牙周炎可破壞牙槽骨的代謝穩態，引起牙齒松動和脫落。破骨細胞是體內唯一具有骨吸收功能的細胞，在牙槽骨吸收過程中具有重要作用，其形成、增殖、分化及功能受多種細胞及其產物的調節[1]。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一組由22～25個核苷酸構成的非編碼單鏈RNA，參與轉錄后基因表達的調控，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、組織炎癥及腫瘤發生等過程。隨著miRNAs的發現，關于miRNAs參與基因轉錄后調控的功能愈來愈受到重視。目前已證實，miRNAs可通過調控轉錄因子的表達，直接或間接地影響破骨細胞的分化及功能[2]。

1 破骨細胞的主要調控途徑

在牙周炎癥組織中，成骨細胞和活化T淋巴細胞分泌的巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和核因子-κB受體活化因子配基（receptor activator for nuclear factor kappa B ligand，RANKL）是直接參與破骨細胞分化的兩種細胞因子。M-CSF能誘導單核/巨噬細胞表達核因子-κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor kappa B，RANK），使其分化成為破骨細胞前體。某些促進骨吸收的細胞因子，如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白細胞介素（interleukin，IL）-1和IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，均可刺激RANKL大量表達，促進其與破骨細胞前體表面的RANK結合，誘導多核破骨細胞的分化成熟。某些骨保護因子，如降鈣素、轉化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-17等，介導產生的骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）可競爭性地結合RANKL，抑制破骨細胞分化成熟和骨吸收。RANK/RANKL/OPG信號通路是調節破骨細胞的經典途徑，已有大量研究關注破骨細胞分化過程中重要的轉錄因子，如c-Fos、活化T細胞核因子1蛋白（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等[1]。此外，參與調控破骨細胞分化的信號途徑還有鈣離子通路，NF-κB通路，有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，細胞外信號調節激酶（extracelluar signal regulated kinase，ERK）途徑，JNK（Jun N-terminal kinase）途徑及鈣調磷酸酶/活化T細胞核因子通路等[3]。

2 促進破骨細胞分化及功能活動的miRNAs

由于破骨細胞分化和功能受多條信號通路調控，miRNAs可能通過抑制某些關鍵基因的表達調控破骨細胞分化和功能，在骨代謝疾病中發揮作用。miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-181a和miRNA-223在骨關節炎患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）的表達水平明顯高于健康人。在牙周炎小鼠的上頜骨中，miRNA-146a表達也顯著升高，同時TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達水平也明顯升高[4]。炎癥因子引發的持續性炎癥會介導宿主免疫反應，加重牙槽骨喪失[5]。以上miRNAs的高表達可能與骨破壞有關[6]。此外，在牙周炎患者的牙齦組織中，發現miRNA-146、miRNA-451、miRNA-223、miRNA-486-5p、miRNA-3917有明顯的高表達[7-8]，提示這些miRNAs可能與牙周炎的炎癥發生及牙槽骨破壞有關。

在Dicer基因敲除的骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）中，miRNA-155的表達被抑制，src同源2肌醇5'磷酸酶（src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase，SHIP）的表達水平升高，破骨細胞形成顯著減少[9]。miRNA-155的靶基因SHIP能抑制破骨細胞分化，還可抑制多條炎癥通路。在類風濕性關節炎患者的關節滑膜和滑膜液中檢測到miRNA-155高表達，miRNA-155通過抑制SHIP-1的表達而促進炎癥反應，同時促進破骨細胞分化[10]。在miRNA-155基因敲除的關節炎大鼠體內，破骨細胞明顯減少，骨吸收活動減弱，而miRNA-155基因敲除的BMMs的破骨細胞向分化也被抑制，但破骨細胞前體數量與對照組并無明顯變化，提示miRNA-155可能促進破骨細胞前體分化為成熟破骨細胞[11]。然而，關于miRNA-155在破骨細胞分化中的作用仍存在爭議。研究[11-12]發現，破骨細胞分化中加入干擾素-β可誘導miRNA-155的表達，miRNA-155能抑制破骨細胞分化的關鍵因子細胞因子信號傳遞抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）和色素形成相關蛋白小眼球相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），從而抑制破骨細胞分化。同時，miRNA-155還參與調控成骨細胞的分化過程。miRNA-155基因敲除的MC3T3-E1細胞中靶基因SOCS1表達增強，抑制TNF-α激活的JNK信號通路，使成骨明顯減少。Xie等[13]發現，hsa-miRNA-155在牙周炎患者牙齦中的表達明顯低于牙周健康組，與類風濕性關節炎的情況不一致，可能是由于牙齦細胞成分的多樣化增加了miRNAs調控的復雜性。盡管牙周炎與類風濕性關節炎均表現為以炎癥反應為主伴隨破骨活動增強的疾病，但miRNA-155在牙周炎的炎癥反應及骨破壞過程中的調控機制仍有待進一步研究。

miRNA-21在BMMs破骨細胞向分化中高表達，抑制其靶基因程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）的表達，解除PDCD4對c-fos的抑制，促進破骨細胞分化。c-fos是破骨細胞分化的關鍵轉錄因子，也是破骨細胞特異的下游靶基因，c-fos基因敲除的轉基因小鼠出現骨硬化癥[14-16]。miRNA-21的表達水平與c-fos呈正相關關系，miRNA-21表達水平在c-fos缺乏的BMMs中隨之下降，提示miRNA-21/PDCD4/c-fos所形成的正反饋效應環在促進破骨細胞產生及分化中發揮調控作用[17]。

在BMMs細胞中，miRNA-223的表達可被PU.1激活，抑制靶基因核因子I-A，從而增強M-CSF受體（M-CSF receptor，M-CSFR）的表達，同時施加正反饋作用于轉錄因子如PU.1和c-fos，形成M-CSF/PU.1/miRNA-223/M-CSFR正反饋效應環促進破骨細胞分化[18]。但Sugatani等[19]發現，RAW264.7細胞中pre-miRNA-223高表達可完全阻斷破骨細胞形成，并且miRNA-223在破骨細胞中的表達水平較在BMMs中低。Shibuya等[20]發現，類風濕關節炎患者中miRNA-223表達升高，尤其是在急性重度滑膜炎和伴有骨破壞的患者；但在體外共培養體系中，miRNA-223過表達卻使破骨細胞數量呈現miRNA-223劑量依賴性減少，miRNA-146也具有與miRNA-223類似的現象，二者均在類風濕關節炎的滑膜中高表達，并且其過表達能降低炎癥因子和破骨細胞的生成，成為炎癥和破骨細胞生成的負向調控因子；這提示在類風濕關節炎中，miRNA-223和miRNA-146在調控破骨細胞發生時需要適宜的表達量[20-22]。

Cheng等[23]發現，RANKL和M-CSF刺激的CD14和PBMCs中miRNA-148表達升高，抑制V-maf肌纖維肉瘤同源癌基因B的表達，減弱其抑制破骨細胞分化的作用。在卵巢切除小鼠體內也發現，抑制miRNA-148a表達可顯著增加小鼠骨密度。此外，miRNA-9718可抑制活化的STAT3蛋白抑制劑（protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3）的表達，促進破骨細胞生成，在miRNA-9718基因沉默的卵巢切除小鼠體內骨吸收活動被抑制，骨量增加[24]。

miRNAs差異表達分析發現，miRNA-31在破骨細胞中的表達水平較BMMs升高了18倍，miRNA-31的靶基因RhoA是肌動蛋白和細胞骨架微管轉導細胞外信號的重要分子開關，miRNA-31抑制能引起RhoA蛋白水平升高，導致破骨細胞外周肌動蛋白環形成受損，抑制破骨細胞形成和骨吸收活動[25]。

有學者[26-27]將白人女性骨質疏松患者分為高骨密度組與低骨密度組，對比兩組患者PBMCs的miRNAs表達差異，先后發現miRNA-133a和miRNA-422a在低骨密度組中升高；miRNA-133a和miRNA-422a與其靶基因具有負相關關系，但不具有統計學意義。miRNA-133a還參與調控成骨細胞的分化[26,28-29]，在抗骨質疏松藥物伊班膦酸鹽作用下，人牙周膜干細胞中的miRNA-133a表達升高[26,30]，而牙周膜干細胞是成骨細胞前體的重要來源[31]，miRNA-133a的高表達可能與抑制人牙周膜干細胞成骨向分化有關。

3 抑制破骨細胞分化及功能活動的miRNAs

Guo等[32]通過研究證實，在PBMCs破骨細胞向分化過程中miRNA-125a表達降低，而miRNA-125a過表達能抑制破骨細胞分化和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）及NFATc1的表達。腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是miRNA-125a的靶基因，是維持破骨細胞的細胞骨架和骨吸收活動的關鍵因子。NFATc1與miRNA-125a的啟動子結合抑制其表達，形成miRNA-125a/TRAF6/NFATc1負反饋調節環。NFATc1是破骨細胞分化中關鍵的轉錄因子，可通過與破骨細胞特異基因啟動子結合，如TRAP、組織蛋白酶K、降鈣素受體、整合素β3等發揮轉錄調控作用[32]。NFATc1基因敲除的小鼠可出現嚴重的骨硬化癥，破骨細胞數量顯著減少，骨吸收功能明顯降低[33-34]。Nakasa等[35]發現，miRNA-146a能通過抑制TRAF6而下調c-Jun、NFATc1、PU.1及TRAP的表達，從而抑制PBMCs向破骨細胞分化；而對關節炎小鼠靜脈注射miRNA-146a能抑制關節骨破壞。miRNA-146a/b可結合至TRAF6和IL-1受體相關激酶1（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）mRNA的3'端非翻譯區，抑制其蛋白表達，從而調控IRAK1和TRAF6參與的免疫反應和破骨細胞分化過程[36]。

在絕經期骨質疏松癥患者的PBMCs中miRNA-503表達顯著降低，而miRNA-503過表達可抑制PBMCs破骨細胞向分化，RANK是其靶基因。在卵巢切除小鼠中沉默miRNA-503可上調RANK蛋白表達，促進骨吸收，而過表達miRNA-503則能抑制卵巢切除小鼠的骨吸收，提示miRNA-503在絕經期骨質疏松癥的發展中具有重要作用[37]。

Rossi等[38]發現，miRNA-29b在人破骨細胞分化過程中表達下降，在破骨細胞中轉染miRNA-29b使TRAP、基質金屬蛋白酶-9、cathepsin K及NFATc1蛋白水平下調，并破壞肌動蛋白環的形成。miRNA-29b通過抑制其靶基因c-fos和基質金屬蛋白酶-2的表達調控破骨細胞分化和骨吸收活動。而Franceschetti等[2]的研究結果與之相反，他們發現miRNA-29a/b/c在破骨細胞分化過程中表達升高，而miRNA-29基因敲除則破壞破骨細胞分化及其前體遷移。兩者研究結果的差異可能是由于選用了不同的細胞所致，前者選用的是人成熟破骨細胞，而后者使用的小鼠骨髓細胞和RAW264.7細胞系是具有分化潛能的前體細胞。miRNA-29對破骨細胞分化的調控作用尚需進一步研究證實。

miRNA-124在RANKL誘導的BMMs破骨細胞分化中表達降低，pre-miRNA-124轉染BMMs后，NFATc1表達顯著下調，抑制破骨細胞向形成，破骨細胞前體遷移活動顯著減少，但不影響NFATc1的上游轉錄因子的表達水平，如NF-κB p65和c-Fos。進一步研究[39]發現，NFATc1過表達可逆轉miRNA-124的抑制作用，同時抑制miRNA-124可以顯著促進依賴NFATc1的TRAP和Cathepsin K的基因表達，提示miRNA-124通過抑制靶基因NFATc1的表達來調控破骨細胞的分化。

miRNA-26a在破骨細胞發生的晚期上調，直接影響結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）/CCN家族2（CCN family 2，CCN2）的表達水平，而CTGF/CCN2能上調樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）而促進破骨細胞分化。在破骨細胞前體中表達miRNA-26a能夠抑制破骨細胞分化，肌動蛋白環形成和骨吸收。miRNA-26a抑制劑能上調CTGF的表達，促進破骨細胞的生成并增強其功能[40]。

4 發展與展望

牙周炎是成年人失牙的最主要原因，現有治療手段對牙周炎骨喪失的治療效果并不理想。牙周基礎治療僅能控制或減緩骨吸收，引導組織再生術和引導骨組織再生術等手術治療也存在適應證選擇的局限。有研究采用炎癥細胞因子拮抗劑或誘導破骨細胞凋亡的方法來抑制骨吸收，但由于該方法可能導致頜骨壞死、腎衰竭等嚴重不良反應而導致其臨床應用受到限制。與破骨細胞相關miRNAs的發現使miRNAs成為調控破骨細胞分化與功能的新靶點，為治療破骨細胞主導的骨代謝疾病開辟了新思路。但是，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為非編碼RNA的另一重要成員，因其多數結構與mRNA有一定相似性，所以可以作為一種競爭性內源性RNA與miRNAs相互作用，參與靶基因的表達調控[41]。綜上所述，單個miRNA的調控作用相對有限，進一步研究需綜合考慮多個miRNAs之間的相互作用關系，及其在基因水平的精細調控作用。將來，miRNAs的研究成果有望與傳統的牙周基礎治療和再生手術治療相結合，共同發揮優勢，為臨床預防和治療牙周炎導致的牙槽骨吸收提供新的方法。

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