親水相互作用色譜—高分辨質(zhì)譜分析不同糖胺聚糖寡糖

吳成玲

摘要 建立了親水相互作用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析糖胺聚糖類復雜樣品的方法。在高分辨質(zhì)譜聯(lián)用條件下，流動相5 mmol/L醋酸銨緩沖溶液可有效使用。在此基礎上，對不同的色譜柱進行了篩選。其中，氨基親水相互作用色譜柱對糖胺聚糖類寡糖的分離效果不佳；酰胺基親水相互作用色譜柱僅適用于透明質(zhì)酸寡糖的分析，可以有效分離聚合度2～20的透明質(zhì)酸寡糖；在較高溫度下，兩性離子基質(zhì)的親水相互作用色譜柱可以對聚合度2～30的透明質(zhì)酸寡糖和聚合度2～12的硫酸軟骨素寡糖有效分離；而二醇基親水相互作用色譜柱對透明質(zhì)酸（聚合度2～30）、硫酸軟骨素（聚合度2～20）以及肝素（聚合度4～20）都適用，并呈現(xiàn)出較好的分離效果。本研究比較了不同類型的親水相互作用色譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜對不同聚合度、不同電荷密度的糖胺聚糖寡糖的分離特點，建立了相應的高效分離和分析方法。本方法有較高的分辨率和質(zhì)譜適用性。

關鍵詞；親水相互作用色譜； 四極桿/時間飛行質(zhì)譜； 糖胺聚糖； 寡糖

1引言

糖胺聚糖是在細胞表面和細胞間基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)的呈線性的酸性多糖。糖胺聚糖通過調(diào)節(jié)多種細胞活動從而參與到生理和病理學過程中，如細胞的擴增和分化，細胞與細胞的相互作用以及細胞與細胞間基質(zhì)的相互作用等[1～3]。糖胺聚糖基于它們的單糖組成以及單糖之間糖苷鍵的位置和構(gòu)象，可以大體分為4類：透明質(zhì)酸（HA），硫酸皮膚素/硫酸軟骨素（DS/CS），硫酸乙酰肝素/肝素（HS/HP）和硫酸角質(zhì)素（KS）。糖胺聚糖類與蛋白質(zhì)相互作用的特異性取決于糖胺聚糖種類、大小、糖組成、電荷密度和序列等[4，5]。相對于糖胺聚糖的其它結(jié)構(gòu)特征，SO2

Symbolm@@ 4數(shù)目多少大體排序為HP>DS≈CS≈HS>HA [9 ]。糖胺聚糖類寡糖經(jīng)常被作為模型，用于研究糖胺聚糖結(jié)構(gòu)與活性的關系。針對不同糖胺聚糖構(gòu)效關系研究、糖胺聚糖酶活力測定、糖胺聚糖降解程度、糖胺聚糖寡糖制備的監(jiān)控，建立有效的糖胺聚糖寡糖在線分析方法至關重要。

目前，用于分析糖胺聚糖類寡糖的方法有強陰離子交換（SAX）高效液相色譜（HPLC）和反相離子對（IPRP）色譜 [10～12 ]等。然而，強陰離子交換色譜方法呈現(xiàn)出較低的分辨率和穩(wěn)定性，同時它使用的高濃度的無機緩沖鹽溶液限制了它與質(zhì)譜的聯(lián)用，從而無法在線檢測所得寡糖的分子量、組成和序列；IPRP方法有較好的分辨率，而且所使用的揮發(fā)性離子對試劑可以用于質(zhì)譜，但是它們通常殘留在離子源和毛細管中，從而降低了質(zhì)譜的靈敏度和分辨率 [13，14 ]。

本研究針對具有不同電荷密度的糖胺聚糖寡糖，采用4種基質(zhì)的親水相互作用色譜（HILIC）方法。研究表明，與SAX和IPRP方法相比，HILIC方法有更好的質(zhì)譜兼容性； 同時，針對不同的糖胺聚糖寡糖可以選擇不同的HILIC方法。2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity液相色譜儀串聯(lián)四級桿/飛行時間（Q/TOF）質(zhì)譜（6540，美國Agilent公司）。醋酸銨、硫酸軟骨素A（CSA） 和HA（美國Sigma公司）；乙腈（德國Merck公司）；軟骨素ABC酶（Chondroitinase ABC，北京艾德豪克國際技術有限公司）；低分子量肝素：依諾肝素為美國藥典標準品（USP）。

2.2實驗方法

2.2.1酶水解制備HA寡糖、CSA寡糖分別取2.0 mg HA和CSA樣品溶于400 μL酶解緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 6.8），將HA和CSA樣品配制成5 mg/mL溶液，分別加入軟骨素酶ABC 5 mU，置于水浴箱中37℃反應4 h。酶解液高溫滅活然后離心，上清液備用。

2.2.2寡糖的高效液相親水相互作用色譜分析（HPLCHILIC）

流動相A為5 mmol/L醋酸銨溶液，流動相B為5 mmol/L醋酸銨95%乙腈溶液，紫外檢測器設置為232 nm在線檢測。氨基HILIC色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 日本COSMOSIL公司）；酰胺基HILIC色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，北京華譜新創(chuàng)公司），柱溫30℃，流速0.5 mL/min，30 min內(nèi)流動相B從90% 降到 35%進行梯度洗脫；兩性離子（ZIC）HILIC色譜柱 （100 mm×2.1 mm， 5 μm，德國 Merck公司），柱溫30℃/85℃，流速0.3 mL/min，25 min內(nèi)流動相B從90% 降到 35%進行梯度洗脫；二醇基HILIC色譜柱 （150 mm×2.0 mm， 3 μm LUNA， 加拿大Phenonenex公司），柱溫30℃，流速0.3 mL/min，25 min內(nèi)流動相B從90% 降到 35%進行梯度洗脫。

2.2.3寡糖的質(zhì)譜分析

氮氣用作霧化氣，霧化壓力為30 Pa。噴霧電壓為3.5 kV，氮氣流速為8 L/min，干燥過程中溫度為350℃。碎片電壓為100 V。在m/z 100～2000的范圍內(nèi)進行全離子流掃描。所有數(shù)據(jù)都在負離子模式下進行采集，經(jīng)Mass Hunter工作站下處理。3結(jié)果與討論

3.1氨基HILIC色譜柱對糖胺聚糖類寡糖的分析

在文獻＼[15＼]中，氨基HILIC色譜柱已被用于糖胺聚糖二糖分析＼[15＼]，但該法以高濃度不揮發(fā)性緩沖鹽作為流動相，因此無法與質(zhì)譜聯(lián)用，而且對于寡糖的分離和分析并沒有直接的報道。本實驗使用氨基HILIC色譜柱進行糖胺聚糖的寡糖分析，結(jié)果表明，即使在高濃度醋酸銨緩沖鹽的條件下，寡聚糖仍然無法被完全洗脫（譜圖未顯示），而據(jù)經(jīng)驗100 mmol/L以上的揮發(fā)性鹽已經(jīng)對質(zhì)譜檢測造成了影響。造成這種現(xiàn)象可能是該氨基柱中樹脂表面鍵合的氨基基團與糖胺聚糖寡糖結(jié)合作用太強，

3.2酰胺基HILIC色譜柱對糖胺聚糖類寡糖的分離

采用酰胺基HILIC色譜柱分別對HA、CSA和HP進行分析，結(jié)果表明，HA寡聚糖能夠得到很好的分離，如圖1所示。根據(jù)相應質(zhì)譜結(jié)果（圖譜未顯示），色譜圖中每個峰得到了準確的歸屬。其中HA寡聚糖在聚合度2～20的范圍內(nèi)能夠得到很好的分離。然而在使用此色譜柱對CSA與HP寡糖混合物進行分離時，在合理的緩沖鹽濃度范圍內(nèi)無法有效洗脫寡糖（譜圖未顯示）。該色譜柱樹脂表面的酰胺基團具有較弱的離子作用，能夠與含有較少負電荷的HA的寡聚糖產(chǎn)生適當?shù)南嗷プ饔茫⒛軌蛴行Х蛛xHA寡糖。

3.3兩性離子（ZIC）HILIC色譜柱對糖胺聚糖類寡糖的分析

本實驗使用ZICHILIC色譜柱分別對3種糖胺聚糖類寡糖進行了分析。結(jié)果表明，HA寡糖在聚合度2～28的范圍內(nèi)達到較好分離，如圖2A所示，其中質(zhì)譜結(jié)果確認了它們的聚合度（圖譜未顯示）。ZICHILIC的兩性離子基質(zhì)使得HA寡聚糖達到了更高的分辨率。然而HA的每一個寡糖都分裂成了兩個峰，這是由寡糖還原端產(chǎn)生的α和β構(gòu)型共存導致的（圖2A）。根據(jù)文獻＼[16，17＼]，增加柱溫可以減少或消除這種現(xiàn)象。因此，本實驗中將柱溫升高到85

SymbolpB@ C，每個HA寡糖在常溫下出現(xiàn)的雙峰完全消失，同時還保留了較高的分辨率（圖2B）。此外，此色譜柱也對CSA具有較好的分辨率（圖2C）。但此色譜柱不適用于HP的分離分析。

3.4二醇基（Diol）HILIC色譜柱對糖胺聚糖類寡糖的分離

使用DiolHILIC色譜柱分別對3種寡聚糖進行了分離。結(jié)果表明，HA寡糖在聚合度2～30范圍內(nèi)能夠得到有效分離（圖3A）；CSA寡糖在聚合度2～20范圍內(nèi)達到較好分離（圖3B）；HP寡糖在聚合度4～20范圍內(nèi)也得到了較高分辨率的分離（圖3C）。質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定了每個相應色譜峰的聚合度（圖譜未顯示）。在圖3可見，只有HA寡聚糖中一些低聚合度的寡糖出現(xiàn)了α、β共存導致的分岔現(xiàn)象。此類型色譜柱樹脂表面二醇基的弱電離作用使得具有不同分子大小和不同電荷密度的這類聚陰離子寡糖都能得到較好的分離效果。

色譜柱30℃條件下所得HA（A）， CSA（B）， 肝素（C）的分離效果譜圖。

HA oligosaccharides （A）， CSA oligosaccharides （B） and heparin（HP） oligosaccharides obtained on the diolHILIC column at 30℃. 4結(jié) 論

建立了親水相互作用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析糖胺聚糖類復雜樣品的方法。對4種具有不同基質(zhì)的HILIC色譜柱進行了評價。對于HA寡聚糖，具有最低的電荷密度，可以使用酰胺基HILIC、ZICHILIC和DiolHILIC在5 mmol/L乙酸銨存在下用常規(guī)的正相色譜條件進行分析。對于CSA寡糖，平均每個二糖單位中含有一個羧基和一個硫酸根，可以使用ZICHILIC和DiolHILIC色譜柱在5 mmol/L乙酸銨的存在下用常規(guī)的正相色譜條件進行分析。而肝素寡糖只能使用DiolHILIC色譜柱在以上條件下進行分離。以上方法均在低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽條件下進行，能夠與質(zhì)譜高效結(jié)合。其中，ZICHILIC需要較高的柱溫消除α、β共存，而DiolHILIC色譜柱能夠在較低溫度條件下實現(xiàn)不同大小分子及不同電荷密度的糖胺聚糖類寡糖的高效分離分析。

References

1Wu Z L， Zhang L， Beeler D L， Kuberan B， Rosenberg R D. Faseb J.， 2002， 16（6）： 539-545

2Capila，Linhardt R J. Angew. Chem. Intl. Ed， 2002， 41（3）： 391-412

3Bernfield M， Gotte M， Park P W， Reizes O， Fitzgerald M L， Lincecum J， Zako M. Annu. Rev. Biochem.， 1999， 68： 729-777

4Taylor K R， Gallo R L. Faseb J.， 2006， 20（1）： 9-22

5Sasisekharan R， Raman R， Prabhakar V. Annu. Rev. Biomed. Eng.， 2006， 8： 181-231

6Leymarie N， McComb M E， Naimy H， Staples G O， Zaia J. Int. J. Mass Spectrom.， 2012， 312： 144-154

7Pfeiler E. Comp. Biochem. Physiol.， 1998， 119： 137-144

8Maimone M M， Tollefsen D M. J. Biol. Chem.， 1990， 265（30）： 18263-18271

9Liu L， Linhardt R J， Zhang Z. Carbohydr. Polym.， 2014， 106： 343-350

10Mourier P， Anger P， Martinez C， Herman F， Viskov C. Anal. Chem. Res.， 2015， 3： 46-53

11Thanawiroon C， Linhardt R J. J. Chromatogr. A， 2003， 1014（12）： 215-223

12Linhardt R J， Gu K N， Loganathan D， Carter S R. Anal. Biochem.， 1989， 181（2）： 288-296

13Wang Z， Li D， Sun X， Bai X， Jin L， Chi L. Anal. Biochem.， 2014， 451： 35-41

14Nuijs A L N V， Tarcomnicu I， Covaci A. J. Chromatogr. A， 2011， 1218： 5964-5974

15Aral T， Aral H， Ziyadanoullar B， Ziyadanoullar R. Talanta， 2015， 131： 64-73

16Gill V L， Aich U， Rao S， Pohl C， Zaia J. Anal. Chem.， 2013， 85（2）： 1138-1145

17Johnsen E， Wilson S R， Odsbu I， Krapp A， Malerod H， Skarstad K， Lundanes E. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（35）： 5981-5986

AbstractA hydrophilic interaction liquid chromatography （HILIC）mass spectrometric （MS） method was developed for the analysis of glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides. By using 5 mmol/L NH4Ac as the mobile phase which was compatible with MS， four types of HILIC columns were investigated to analyze GAG oligosaccharides. The results showed that， aminoHILIC column was unsuitable for all glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides， amideHILIC column was useful only for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp20， zwitterionic phase HILIC column was useful for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp30 and to a lesser extent for chondroitin oligosaccharides from dp2 to dp12， and diolHILIC column afforded excellent resolution of hyaluronan （dp2-dp30）， chondroitin sulfate （dp2-dp20） and heparin （dp4-dp20） oligosaccharides. In conclusion， different HILIC columns were investigated and on the basis of this， GAG oligosaccharides were separated and then analyzed by HILIC MS method. The developed methods have higher resolution and better compatibility of MS.

KeywordsHydrophilic interaction liquid chromatography； Quadrupoletimeofflight mass spectrometry； Glycosaminoglycan； Oligosaccharides

（Received 21 March 2015； accepted 31 May 2015）