二茂鐵功能化石墨烯修飾電極用于多巴胺的檢測

劉超

摘要 通過酰基化反應(yīng)制備二茂鐵（Fc）功能化氧化石墨烯材料，利用透射電鏡、傅里葉變換紅外光譜和X射線衍射對該復(fù)合物的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。將其滴涂到玻碳電極（GCE）表面并用Nafion膜固定，進(jìn)行電化學(xué)還原，得到電化學(xué)還原氧化石墨烯復(fù)合材料修飾電極（Fc/ERGO/GCE）。此修飾電極對多巴胺的氧化還原具有良好的催化性能，在循環(huán)伏安曲線的0.2 V附近出現(xiàn)一對多巴胺的可逆氧化還原峰。差示掃描伏安法（DPV）峰電流大小與多巴胺濃度在0.4～300 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=0.9998），檢出限為0.08 μmol/L。用于檢測人體尿液中的多巴胺含量，加標(biāo)樣品的回收率在92.5%～105.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%（n=5），表明制備的Fc/ERGO/GCE可用于實際樣品中DA的檢測。

關(guān)鍵詞；二茂鐵； 電化學(xué)還原氧化石墨烯； 多巴胺； 電化學(xué)檢測

1引言

多巴胺（DA）作為一種重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腎臟功能、激素分泌等重要作用。許多疾病，如癲癇、帕金森病、精神分裂癥等，都與DA濃度異常有關(guān) [1 ]，因此，開發(fā)靈敏、特異性、快速的檢測方法對于疾病診斷、神經(jīng)生理學(xué)及相關(guān)藥物研究有重要意義。目前，檢測DA的主要方法有熒光法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、電化學(xué)法等 [2～4 ]，與其它方法相比，電化學(xué)方法以其簡單、靈敏度高、成本低和響應(yīng)快速的優(yōu)點引起了廣泛的關(guān)注 [5，6 ]。由于DA在固體電極上的過電位較大，用未修飾的電極檢測DA的靈敏度一般較低，因此修飾電極在DA的測定中越來越受到人們的重視 [7，8 ]。

石墨烯（Graphene）是碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的一種新型納米材料，具有優(yōu)良的導(dǎo)電性能和較大的比表面積，廣泛用于能源儲存、傳感器和修飾電極等研究領(lǐng)域 [9]。二茂鐵 （Fc） 是一種良好的電子轉(zhuǎn)移媒介體 [10 ]，由于其電化學(xué)活性高，可逆性好，可作為蛋白質(zhì)標(biāo)記物或氧化還原活性中心用于生物小分子的檢測 [11，12]。Yang等 [13]將Fc和單層碳納米管通過非共價鍵連接制備成復(fù)合材料，該材料表現(xiàn)出良好的電催化性能 [13]，而通過共價作用制備Fc及其衍生物與石墨烯復(fù)合材料的報道很少 [14～16]，還未見將其用于多巴胺檢測的報導(dǎo)。

本研究利用共價改性氧化石墨烯（GO）的方法制備了二茂鐵功能化的氧化石墨烯（Fc/GO）復(fù)合材料，通過恒電位還原的方法將其還原成二茂鐵/石墨烯（Fc/ERGO），然后修飾在玻碳電極上，采用循環(huán)伏安法和微分脈沖伏安法研究了DA在此修飾電極上的電化學(xué)反應(yīng)，基于此建立了檢測DA的電化學(xué)方法。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

CHI630D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；JEM2010型透射電子顯微鏡（日本電子珠式會社）；Nicolet 5700紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）；XD3型X射線衍射儀（北京普析儀器有限責(zé)任公司）；AR224CN型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；101C2型恒溫干燥箱（上海實驗儀器廠）；CT14D型臺式高速離心機(jī)（上海天美生化儀器廠）；采用三電極體系：自制的二茂鐵/石墨烯修飾玻碳電極為工作電極（d=3 mm），AgAgCl（飽和KCl）電極為參比電極，鉑絲為對電極。

二茂鐵、石墨粉（8000目）、多巴胺（98%）（阿拉丁試劑公司）；Nafion溶液（5%，美國Sigma公司）。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。0.1 mol/L Na2HPO4NaH2PO4緩沖溶液（PBS， pH 6.5）。

2.2實驗方法

2.2.1氧化石墨烯（GO）及二茂鐵/氧化石墨烯（Fc/GO）材料的制備采用改進(jìn)的文獻(xiàn)[17]的方法合成GO，具體步驟為：稱取2.5g K2S2O8和2.5g P2O5，依次緩慢加入到12 mL濃H2SO4中，再加入3 g石墨粉，恒溫80℃水浴下機(jī)械攪拌5 h，進(jìn)行預(yù)氧化，然后用500 mL二次蒸餾水稀釋，冷卻后過濾，60℃過夜。將1.53 g NaNO3和70 mL濃H2SO4與上述石墨混合，不斷攪拌，15 min內(nèi)加入9 g KMnO4，在7℃反應(yīng)2 h。移入35℃恒溫水浴鍋，攪拌4 h，加入138 mL二次蒸餾水。升溫至95℃反應(yīng)40 min，再加入420 mL水，攪拌30 min，終止反應(yīng)。冷卻后，不斷攪拌下加入20 mL 30% H2O2，除去多余的KMnO4，沉降后倒去上層清液，加入5% HCl離心，透析7天，超聲后得到GO

通過選擇性FriedelCrafts酰基化反應(yīng)合成Fc/GO：將3 g酸性Al2O3于150℃真空干燥箱中加熱活化3 h，冷卻至室溫；將1 mmol二茂鐵溶于5 mL二氯甲烷中，并吸附在酸性氧化鋁上；將20 mg GO和0.7 mL三氟乙酸酐混合，加入上述反應(yīng)物中，整個過程在N2氛圍中進(jìn)行，室溫攪拌36 h。反應(yīng)產(chǎn)物重懸于甲醇中，用Whatman 41號濾紙過濾后，用甲醇、二次蒸餾水、乙醇清洗，將濾液離心，硅膠層析柱分離純化（石油醚為洗脫劑）得到Fc/GO。Fe/GO合成示意圖如圖1所示2.2.2修飾電極的制備、表征和應(yīng)用將裸玻碳電極（GCE）依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末在麂皮上打磨、拋光至鏡面。用無水乙醇、蒸餾水超聲清洗3 min。取7 μL 1 mg/mL Fc/GO乙腈溶液滴涂于玻碳電極表面。自然晾干，取2 μL 5%（V/V）Nafion溶液滴涂到電極表面，干燥后即得Fc/GO/GCE [18]。將Fc/GO/GCE置于0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=6.5）中，用

Symbolm@@ 1.5 V恒電位還原20 min，得Fc/ERGO/GCE，備用。作為對比，將0.1 mg/mL GO溶液按上述同樣方法處理，制備GO/GCE。

2.2.3修飾電極的表征采用透射電鏡（TEM）表征Fc/GO的形貌，加速電壓為200 kV，樣品均勻分散在二次蒸餾水中，取適量滴于銅網(wǎng)上，常溫下空氣中晾干后進(jìn)行測定。復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)由紅外光譜（IR）表征，采用KBr壓片法，待測物與KBr按質(zhì)量比1∶100混合，充分研磨均勻后壓片，掃描范圍為400～4000 cm

Symbolm@@ 1。

在含適量DA的PBS中，以Fc/ERGO/GCE電極為工作電極，在

Symbolm@@ 0.2～0.6 V電位范圍內(nèi)，以50 mV/s的掃速記錄循環(huán)伏安圖。

微分脈沖伏安法（DPV）參數(shù)設(shè)置：起始電位

Symbolm@@ 0.2 V，終止電位0.6 V，電勢增量5 mV，脈沖幅度50 mV，脈沖寬度50 ms，采樣寬度40 ms，脈沖周期100 ms，靜置時間30 s。

3結(jié)果與討論

3.1二茂鐵/氧化石墨烯材料的表征

由GO的TEM圖（圖2A） 可見，GO的薄層結(jié)構(gòu)及其表面與邊緣的褶皺呈透明形態(tài)。由Fc/GO的TEM圖（圖2B）可見，F(xiàn)c粒子比較均勻地分散在GO上。

3.2電化學(xué)還原氧化石墨烯的表征

在0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=6.5）中的恒電位還原如圖3A所示。隨著還原時間延長，電流增大，表明材料的導(dǎo)電性得到增強(qiáng)＼[20＼]。由XRD表征（圖3B）可見，在2θ=11.6°附近出現(xiàn)GO的特征衍射峰，經(jīng)恒電位還原后，GO表面含氧官能團(tuán)被除去，11.6°的特征峰消失，在25.9°出現(xiàn)了一個較寬的峰，晶面間距變小，表明GO被還原為ERGO。

3.3多巴胺在修飾電極上的電化學(xué)行為

不同電極在含0.1 mmol/L DA的0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=6.5）中的電化學(xué)行為如圖4所示，DA在GCE（a）上響應(yīng)電流較小，且峰電位差較大（208 mV），在ERGO/GCE上的響應(yīng)電流小幅增加，當(dāng)電極表面修飾FC/GO后，DA的峰電流明顯增大，與玻碳電極相比，峰電位差降低到81 mV，可逆性得到了顯著改善。這是由于二茂鐵作為電子媒介體，促進(jìn)了在電極和多巴胺之間的電子傳遞；此外，石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，其褶皺結(jié)構(gòu)增大了電極的表面積。

3.4pH值對多巴胺電化學(xué)行為的影響

圖5為0.1 mmol/L DA在不同pH值的PBS緩沖溶液中的DPV響應(yīng)圖。pH<6.5時，DA的氧化峰電流隨著pH值的升高而增大；pH=6.5時，峰電流達(dá)到最大值；pH繼續(xù)增大，峰電流卻逐漸降低。這可能是因為酸度增加導(dǎo)致Nafion膜表面結(jié)合了部分H+，不利于帶正電荷的多巴胺的吸附＼[21＼]；當(dāng)溶液為堿性時，可能會中和多巴胺的正電荷，使多巴胺的吸附有所下降。

3.5掃速對多巴胺電化學(xué)行為的影響

考察了掃速對DA電化學(xué)行為的影響。從圖6A可見，氧化還原峰電流隨著掃速（v）的增加而增大，氧化峰和還原峰電位分別略微正移和負(fù)移。當(dāng)掃速從10 mV/s增加到50 mV/s時（圖6B），氧化還原峰電流與掃速的平方根成正比，表明DA在Fc/ERGO修飾電極上的反應(yīng)受擴(kuò)散控制。當(dāng)掃速從50 mV/s 增加到150 mV/s時（圖6C），氧化還原峰電流大小與掃速成正比，表明是一個吸附控制過程，可能原因是當(dāng)掃速過高時，DA沒有足夠的時間在修飾電極膜中擴(kuò)散＼[22＼]。為了提高信噪比，減小背景電流，選擇50 mV/s作為最佳掃描速度。

3.6檢測多巴胺的線性范圍和檢出限

在優(yōu)化條件下，F(xiàn)c/ERGO/GCE對不同濃度的DA的DPV響應(yīng)曲線如圖7A所示。隨著多巴胺濃度的增加，DPV峰電流明顯增大。響應(yīng)電流值與DA濃度在0.4～300 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（圖7B），回歸方程為I（μA）=0.2071C（μmol/L）-0.00517（R2=0.9998）；檢出限（LOD）為0.08 μmol/L （S/N=3），優(yōu)于文獻(xiàn)報道的1.4 μmol/L[23]和1.9μmol/L[24]。

3.7電極的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和干擾研究

對0.1 mmol/L DA溶液連續(xù)測量9次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。將電極置于空白溶液中，室溫放置10天后，響應(yīng)值是初始響應(yīng)的94.8%，說明修飾電極具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。測定含有5 μmol/L多巴胺和500 μmol/L抗壞血酸（AA）的混合溶液的DPV響應(yīng)，實驗條件下，AA以陰離子形式存在，同時Nafion本身帶負(fù)電排斥陰離子，所以Fc/ERGO/ GCE對AA沒有響應(yīng)，混合物的DPV曲線和單獨(dú)DA的DPV曲線基本重合。此外，100倍的Na+、Mg2+、Ca2+、Al3+和100倍的葡萄糖、蔗糖、色氨酸、酪氨酸對5 μmol/L多巴胺的檢測均無明顯干擾。

3.8尿樣分析

取2 mL正常人尿液，用0.1 mol/L PBS（pH=6.5） 定容至100 mL，同時添加一定濃度的DA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。加標(biāo)樣品的回收率在92.5%～105.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%（n=5），表明制備的Fc/ERGO/ GCE可用于實際樣品中DA的檢測。

4結(jié) 論

制備了二茂鐵/電化學(xué)還原氧化石墨烯復(fù)合材料，此材料能有效提高多巴胺在電極表面的電子傳遞速率，對多巴胺的氧化還原反應(yīng)表現(xiàn)出較高的電催化活性。二茂鐵/電化學(xué)還原石墨烯修飾電極制備簡單，對多巴胺檢測線性范圍寬、靈敏度高、檢出限低，可用于實際樣品中多巴胺的檢測。

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AbstractA complex of ferrocene functionalized graphene oxide （Fc/GO） was prepared through FriedelCrafts acylation method and characterized by tunable electron microscopy （TEM）， Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） and Xray diffraction （XRD）. The Fc/GO complex was immobilized on glassy carbon electrode （GCE） with Nafion， and electrochemically reduced by potentiostatic reduction method to get Fc/ERGO/GCE. The results showed that the obtained Fc/ERGO/GCE had good catalytic performance for the oxidationreduction of dopamine （DA）. A pair of peaks near 0.2 V in the cyclic voltammogram attributed to DA was observed. The differential pulse voltammetric （DPV） peak current was proportional to the concentration of DA in the range from 0.4 μmol/L to 300 μmol/L （R2=0.9998）， with a limit of detection of 0.08 μmol/L. The recoveries of DA in the spiked human urine samples were 92.5%-105.0% with relative standard derivations （RSDs） of less than 5% （n=5）， which indicated that the fabricated Fc/ERGO/GCE was suitable for the determination of dopamine in real samples.

KeywordsFerrocene； Electrochemically reduced graphene oxide； Dopamine； Electrochemical determination

（Received 27 March 2015； accepted 27 May 2015）