縮膽囊素分子印跡整體柱的制備及固相微萃取—高效液相色譜分析研究

李樺等

摘 要 采用抗原決定簇法，開展了對縮膽囊素（CCK）神經肽具有特異性識別和富集作用的新的分子印跡聚合物（MIP）整體柱合成與制備的研究。對MIP整體柱合成條件進行了系統的選擇和優化，以縮膽囊素五肽（CCK5）為模板分子，在小移液器吸頭中原位聚合制備了可以特異性識別和富集CCK神經肽的MIP整體柱。用掃描電鏡和紅外光譜對該分子印跡聚合物進行了表征。將此MIP整體柱作為固相微萃取小柱，研究并優化了固相微萃取條件，結合高效液相色譜紫外檢測法，建立了腦脊液中CCK5和CCK8的分析檢測方法； 本方法成功應用于加標腦脊液中CCK 神經肽的分離富集，CCK5和CCK8的檢測限分別為4.38和15.95 ng/mL，平均加標回收率分別為90.2%和87.6%，相對標準偏差分別為3.2%和3.9%。此CCKMIP整體柱具有特異性強、經久耐用的特點。

關鍵詞 縮膽囊素； 分子印跡聚合物整體柱； 固相微萃取； 抗原決定簇

1 引 言

縮膽囊素 （Cholecystokinin， CCK） 是一種廣泛分布于中樞神經系統的多型性神經肽，在中樞神經系統中CCK大部分以八肽CCK8 （AspTyrMetGlyTrpMetAspPheNH2）形式存在；也有部分以五肽CCK5 （GlyTrpMetAspPheNH2）形式存在，這兩種CCK型體具有相同的C端結構[1]。CCK對攝食、體溫調節、學習和記憶等生理功能有重要的調控作用[2，3]，并且與多種神經和精神性疾病發病緊密相關[4]。研究建立生物體液中縮膽囊素特異性和高靈敏的分析檢測方法具有重要的生物醫學意義。由于CCK在腦脊液和腦組織中含量低，目前報道的CCK定量檢測方法大多采用高靈敏度的放射免疫法 （RIA）[5，6]。但RIA方法需要昂貴的高特異性的抗體，且有交叉反應的缺點；而且RIA無法實現對中樞神經系統中多型性CCK的同時定量檢測。

建立高效和特異性強的CCK神經肽樣品富集方法是實現CCK液相色譜分析的重要前提。分子印跡聚合物 （Molecularly imprinted polymer， MIP） 是以目標分子為模板合成的具有分子識別能力的聚合物[7]。整體柱是由單體、交聯劑、致孔劑等混合物通過原位聚合而成的棒狀整體[8～10]。MIP整體柱不僅具有分子印跡聚合物優異的識別能力，而且具有整體柱的高效、通透性好、傳質速度快等特點[11]，可結合固相微萃取 （Solid phase microextraction， SPME），應用于復雜基質中痕量分析物的分離與富集[12，13]。抗原決定簇法分子印跡技術是以多肽或蛋白質中一個特異性的裸露短肽作為模板分子制備MIP來特異性識別整個多肽或蛋白質[14]， 大大降低了印跡成本，已在蛋白質印跡材料的合成中得以應用，如合成能識別血管緊張素[15]、酪氨酸磷蛋白的分子印跡材料[16]。Papaioannou等[17]以CCK5為模板分子，以本體聚合法制備出了可以識別CCK8的MIP，但該報道僅研究了該MIP的選擇性和吸附性能，未將其應用于固相微萃取或色譜分析。目前制備蛋白質或肽MIP的報道絕大部分使用本體聚合法，用該方法所制備的塊狀MIP需要經干燥、研磨和篩分等復雜過程，且在研磨時會破壞印跡位點。至今尚無原位聚合法制備CCK神經肽分子印跡整體柱的相關報道。本研究采用抗原決定簇法，以縮膽囊素五肽CCK5為模板，首次以原位聚合法在移液器吸頭中合成了CCK神經肽MIP整體柱，以此整體柱作為固相微萃取小柱，純化并富集腦脊液中的CCK神經肽，結合高效液相色譜紫外檢測法（HPLCUV）檢測，建立了MIPSPME對腦脊液中痕量CCK5及CCK8同時特異性富集和分析檢測的方法，獲得滿意結果。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1100型高效液相色譜儀（美國Aglient公司）， 配G1315B光電二極管陣列檢測器； Quant 200掃描電子顯微鏡 （荷蘭FEI公司）； Nicolet 5700 紅外光譜儀 （美國Nicolet公司）； LSP011A型注射泵 （保定蘭格恒流泵有限公司）。

CCK5五肽和CCK8八肽、亮啡肽、甲啡肽以及四肽YPLG（純度>98%）購于上海吉爾生化有限公司；甲基丙烯酸 （Methacrylic acid， MAA）、三氟乙酸 （Trifluoracetic acid， TFA， 化學純， 上海國藥集團有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯 （Ethylene dimethacrylate， EDMA， 98%， 比利時Acros公司）；偶氮二異丁腈 （AIBN， 化學純， 上海試四赫維化工有限公司）；異辛烷 （Isooctane， >99.0%， 東京化成工業株式會社TCI）；人工腦脊液的配制： 145.0 mmol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 1.0 mmol/L MgCl2， 1.2 mmol/L CaCl2， 0.45 mmol/L NaH2PO4， 2.33 mmol/L Na2HPO4， pH 7.4，于4℃保存備用。其它試劑均為分析純。以0.1% TFA 溶液配制10.0 μg/mL CCK5和CCK8標準儲備液，4℃保存備用。

2.2 實驗方法

2.2.1 分子印跡整體柱的制備 將一定量的模板CCK5，溶解于甲醇和異辛烷的混合溶液中，依次加入單體MAA、交聯劑EDMA和引發劑AIBN。超聲混合均勻后，通入氮氣10 min，移取反應混合液于移液器吸頭中，吸頭的另一端用保鮮膜封口后于60℃反應16 h。制得的MIP整體柱依次用甲醇、水及乙腈水（4∶6， V/V）混合溶液清洗，收集洗脫液進行HPLC分析直至無模板。非印跡聚合物 （Nonimprinted polymers， NIP） 整體柱除不加模板分子外，其它步驟同上。

2.2.2 固相微萃取 （SPME） 過程 將MIP整體柱連接在注射器上，依次用1 mL乙腈水（1∶1， V/V）混合溶液和1 mL 0.1% TFA溶液平衡整體柱10 min，流速100 μL/min；將2 mL CCK5標準溶液以100 μL/min流速通過MIP整體柱； 用0.5 mL 含0.1% TFA的溶液清洗整體柱，流速100 μL/min；最后用100 μL乙腈水（1∶1， V/V））的混合溶液洗脫，流速為50 μL/min。收集洗脫液直接進行HPLC分析，以考察MIP整體柱的富集效果。CCK8的萃取富集同上述過程。按照上述相同的方法考察NIP整體柱對CCK的富集效果。每次萃取實驗在相同的條件下重復3次，計算平均富集因子及回收率。

2.2.3 人腦脊液樣品處理

取1.5 mL正常男性受試者的腦脊液 （武漢協和醫院） 于離心管中，加入6 mL氯仿，振蕩，以3000 r/min離心10 min，取0.8 mL上清液，分別加入10 μg/mL CCK5、CCK8標準溶液26 μL和100 μL，用0.1% TFA溶液稀釋至2 mL，得到CCK5和CCK8加標濃度分別為0.13和0.50 μg/mL的腦脊液，置于4℃備用。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18 （250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm， 大連依利特分析儀器有限公司）；流動相：乙腈水（3∶7， V/V），含0.1% TFA；流速：1 mL/min；柱溫：28℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。

3 結果與討論

本研究采用富集因子（Enrichment factor， EF）衡量整體柱對CCK的富集效果，用印跡因子（Imprinted Factor，IF）考察整體柱對CCK的特異性識別能力。EF和IF的定義如下：

EF=C1C0（1）

IF=EFMIPEFNIP（2）

式中， C0 是指上樣前溶液中CCK的濃度； C1是指過柱后洗脫液中CCK的濃度； EFMIP和EFNIP分別指MIP整體柱和NIP整體柱的富集因子。

3.1 分子印跡整體柱的制備及性能考察

3.1.1 MIP整體柱制備條件的選擇及優化 為了得到對CCK具有特異性識別能力且通透性良好的MIP整體柱，分別對單體與交聯劑的比例、單體與模板的比例、聚合反應溶劑的種類及比例進行了系統的選擇及優化。實驗結果見圖1，如圖1A和圖1B所示：單體與交聯劑和模板與單體的比例最佳比例分別為1∶4和1∶13。由于CCK5在甲醇中溶解性良好，但是僅用甲醇作為溶劑制備的MIP整體柱通透性差，因此本實驗在甲醇為主的溶劑體系中分別加入乙腈、十二醇以及異辛烷作為發泡劑，通過考察混合溶液中甲醇與各種發泡劑之間不同比例對通透性及富集效果的影響，實驗表明， 以含4.5%異辛烷甲醇混合溶液作為溶劑制備所得的MIP整體柱，不僅具有良好的通透性且有較高的富集因子（EF） （圖1C），而選用其他溶劑制備所得的整體柱通透性較差。因此，制備MIP整體柱采用含4.5%異辛烷甲醇混合溶液為反應溶劑，模板CCK5、單體MAA及交聯劑EDMA的比例為1∶13∶52。

3.1.2 分子印跡整體柱的表征 實驗對所制備的MIP整體柱進行了表征，圖2為MIP整體柱截面的掃描電鏡圖（SEM）。可以看出，此MIP整體柱為多孔的交聯狀聚合物，結構致密，孔徑均勻，機械強度穩定，為傳質提供了良好的場所和通道。圖3為MIP整體柱（a）， NIP（b）整體柱和單體甲基丙烯酸MAA（c）的紅外光譜圖。比較圖3a和3b可見， MIP和NIP具有相似的特征吸收峰位置和強度。3445.1和3444.1 cm

3.1.3 MIP整體柱特異性考察及識別機理 本研究用含有1 μmol/L CCK5 （GlyTrpMetAspPheNH2），1 μmol/L CCK8 （AspTyrMetGlyTrpMetAspPheNH2），2 μmol/L 四肽YPLG （TyrProLeuGlyNH2），2 μmol/L甲啡肽 （TyrGlyGlyPheMet）及2 μmol/L亮啡肽 （TyrGlyGlyPheLeu）的混合多肽溶液，按照2.2.2節進行固相微萃取實驗，考察MIP整體柱對CCK的特異性識別效果。結果表明，MIP整體柱對CCK5和CCK8具有明顯的富集效果，印跡因子分別為4.5和4.2，而對YPLG、甲啡肽及亮啡肽沒有富集作用。此結果證明所制備的MIP整體柱對CCK神經肽的識別具有高度的特異性，這種特異性識別機制可從抗原決定簇法制備得到的分子印跡聚合物識別目標分子的原理得以解釋，即如圖4a所示，聚合過程中功能單體MAA與模板分子CCK5通過非共價作用（氫鍵，靜電引力）自組裝，加入交聯劑與致孔劑后， 整個混合物固化形成一種在形狀和官能團上與模板CCK5互補的多孔材料；模板通過溶劑沖洗后，合成得到的大孔MIP留下空的印跡位點（圖4b），該MIP即可以特異性地識別CCK5。由于CCK8的C端含有與CCK5相同的5個氨基酸序列，因此，此MIP整體柱也可識別與富集CCK8。

3.2 MIP整體柱固相微萃取 （SPME） 條件優化

為了獲得較高的富集效果，本研究分別對洗脫液的種類、上樣溶液pH值、上樣體積、洗脫液體積及流速進行了選擇和優化。如圖5所示，當上樣溶液pH=1.8，上樣體積為2 mL，用100 μL乙腈水（1∶1， V/V） 混合溶液以0.05 mL/min的流速洗脫，MIP整體柱對CCK5及CCK8的富集效果分別可以達到19和18倍。取CCK5和CCK8加標濃度均為1 μmol/L的人工腦脊液，在優化的條件下經過MIP整體柱萃取后，進行HPLC分析，圖6b為其色譜圖，與不經萃取直接分析的色譜圖（圖6a）相比，CCK5和CCK8信號強度得到大幅度提高。

3.3 分析方法評價

3.3.1 線性范圍及檢出限 取10.0 μg/mL 的CCK5和CCK8標準儲備液，用人工腦脊液分別稀釋成一系列標準溶液，在最佳萃取條件下，按照2.2.2節進行SPME實驗，洗脫液直接進行HPLC分析。以色譜峰面積對上樣前濃度進行線性回歸，以3倍信噪比計算檢出限（LOD），結果見表1。CCK在較寬的濃度范圍內線性良好（R2>0.99）。經過MIP整體柱萃取富集之后，CCK5和CCK8檢出限分別達到4.4和16 ng/mL。

3.3.2 腦脊液樣品分析 腦脊液中含有大量的蛋白、糖類及無機鹽等，基質干擾效應較大。以CCK5和CCK8加標濃度分別為0.13和0.50 μg/mL的腦脊液，未經萃取直接用HPLC 分析，未見CCK峰（圖7b）。圖7a為以上加標腦脊液經過MIP整體柱固相微萃取后的HPLC圖譜，可以檢測到CCK5和CCK8。

為了考察該萃取方法的重現性和準確性，對該加標濃度的腦脊液進行了重復分析檢測（n=3），測得CCK5和CCK8的平均加標回收率分別為90.2%和87.6%，相對標準偏差分別為3.2%和3.9%，說明方法的重現性好。此整體柱經過上百次萃取實驗后，富集因子無明顯降低，證明此MIP整體柱具有優異的穩定性和耐用性。

4 結 論

本研究采用抗原決定簇法的基本原理，在移液器吸頭中合成制備了縮膽囊素分子印跡聚合物整體柱，研究結果表明，此MIP整體柱對縮膽囊素類神經肽具有特異性識別和富集能力。將此MIP整體柱作為固相微萃取小柱，研究并優化了固相微萃取條件，結合高效液相色譜紫外檢測法，建立了腦脊液中CCK5和CCK8同時分析檢測的方法，本方法成功應用于對加標腦脊液中縮膽囊素的富集和檢測。該CCKMIP整體柱具有特異性強、經久耐用的特點，具有良好的應用價值。

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ract The synthesis and preparation of molecularly imprinted polymer （MIP） monolith for selective recognition of cholecystokinin were carried out by epitope imprinting technique. The MIP was synthesized by using CCK5 as template in a micropipette tip， and the polymerization conditions were investigated and optimized. The synthesized MIPs were characterized by scanning electron microscope （SEM） and infrared spectroscopy. By using this MIP monolith as solid phase microextraction （SPME） column and coupling to high performance liquid chromatographyultraviolet （HPLC/UV） detection， an analytical method was developed for the determination of CCK， and the parameters affecting SPME were optimized. The proposed method was successfully applied to determination of CCK5 and CCK8 in spiked cerebrospinal fluid （CSF） simultaneously. The detection limit of CCK5 and CCK8 were 4.38 ng/mL and 15.95 ng/mL， respectively； the mean recoveries were 90.2% and 87.6% with the relative standard deviations of 3.2% and 3.9%. This CCKMIP monolith showed high specificity， excellent reusability.