高效液相色譜—三重四級(jí)桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜測(cè)定鼠腦組織中神經(jīng)甾體類化合物

劉佳等

摘 要 建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）測(cè)定鼠腦組織中6種神經(jīng)甾體類激素（別孕烯醇酮、孕烯醇酮、孕酮、脫氧皮質(zhì)酮、四氫脫氧皮質(zhì)酮、去氫表雄酮）的方法。采用Agilent XDBC18色譜柱，以5 mmol/L乙酸銨甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，在電噴霧正離子模式下，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式采集數(shù)據(jù)，基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法定量。孕酮和脫氧皮質(zhì)酮在0.10～10 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，別孕烯醇酮、孕烯醇酮、四氫脫氧皮質(zhì)酮、去氫表雄酮在0.50～10 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99； 在0.4， 4.0和8.0 ng/mL加標(biāo)水平下的平均回收率為91.2%～115.5%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為0.87%～8.8%；檢出限為0.04～0.20 ng/mL，定量限為0.10～0.50 ng/mL。

關(guān)鍵詞 神經(jīng)甾體； 液相串聯(lián)質(zhì)譜； 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)； 鼠腦

1 引 言

神經(jīng)甾體是指在神經(jīng)系統(tǒng)中合成的甾體和經(jīng)血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的外周甾體及其代謝衍生物[1]。這些神經(jīng)甾體可以通過(guò)結(jié)合不同的神經(jīng)受體（如GABAA，Sigma受體）調(diào)控神經(jīng)功能。神經(jīng)甾體的行為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的行使密切相關(guān)。研究表明， 在不同的生理和病理?xiàng)l件下，神經(jīng)甾體在各個(gè)腦區(qū)中的含量會(huì)顯著變化[2，3]。神經(jīng)甾體還會(huì)參與焦慮和抑郁的調(diào)節(jié)過(guò)程。由于神經(jīng)甾體在生物體內(nèi)含量極低，基質(zhì)干擾多，使得生物體內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)甾體的測(cè)定十分困難，因而開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)生物體內(nèi)神經(jīng)甾體含量的方法就顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的神經(jīng)甾體的檢測(cè)方法有放射免疫標(biāo)記法（RIA）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）[4]，但放射免疫標(biāo)記法特異性差，且存在安全隱患；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法雖然靈敏度高，但樣品前處理步驟復(fù)雜，不能實(shí)現(xiàn)高通量分析。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于其選擇性好、靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，近年被廣泛應(yīng)用到神經(jīng)甾體檢測(cè)領(lǐng)域[5～8]。但這些工作有的需要復(fù)雜的衍生化過(guò)程[9]，有的使用多個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)，增加了檢測(cè)成本[10]；有的只檢測(cè)1～2種待測(cè)物，缺乏全面性[7，11]。

本研究以大鼠腦組織為基質(zhì)，建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）同時(shí)檢測(cè)腦組織中別孕烯醇酮（AP）、孕烯醇酮 （PREG）、孕酮（PROG）、脫氧皮質(zhì)酮（DOC）、四氫脫氧皮質(zhì)酮（THDOC）、去氫表雄酮（HEA）6種神經(jīng)甾體類化合物的方法。本實(shí)驗(yàn)采用的高效液相色譜三重四級(jí)桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜是一種新型質(zhì)譜儀，與普通的液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜相比，提高了MS/MS掃描能力。本研究以甲基睪酮為內(nèi)標(biāo)，較同位素標(biāo)記物內(nèi)標(biāo)方便易得，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定，提高了方法的準(zhǔn)確度和精密度[12]。本方法無(wú)需衍生化，操作簡(jiǎn)便、快速，可同時(shí)測(cè)定大鼠不同腦區(qū)中神經(jīng)甾體的含量，為建立其他生物樣本中神經(jīng)甾體的檢測(cè)方法提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LC20ADXR高效液相色譜（日本島津公司）；AB SCIEX QTRAP 6500質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；固相萃取儀（美國(guó)Supelco公司）；固相萃取柱Strata C18E 50 mg/1 mL（美國(guó)菲羅門(mén)公司）；離心濃縮儀（美國(guó)Thermo公司）；0.22 μm聚丙烯（Polypropylene）膜過(guò)濾離心管（美國(guó)Corning公司）；MilliQ超純水儀（美國(guó)Millipore公司）

標(biāo)準(zhǔn)品別孕烯醇酮（Allopregnanolone，AP，純度98%）、孕烯醇酮 （Pregnenolone，PREG，純度98%）、孕酮（Progesterone，PROG，純度99%）、脫氧皮質(zhì)酮（11Deoxycorticosterone，DOC，純度97%）、四氫脫氧皮質(zhì)酮（Allotetrahydrodoc，THDOC，純度99.5%）、甲基睪酮（Methyltestosterone，MT，純度99%）、去氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA，純度99%）均為美國(guó)Sigma公司試劑。

甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher試劑）；乙酸銨（純度99%，美國(guó)Sigma公司）；甲酸（純度88%，美國(guó)Fisher公司）；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水（電阻率18.2 MΩ cm）。

2.2 溶液配制

將各標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并根據(jù)需要用甲醇水（1∶1， V/V）稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，

Symbolm@@ 20℃保存。

2.3 樣品前處理

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 配制5% BSA0.7% NaCl溶液，加入不同濃度的AP，PREG，DOC，THDOC，PROG，DHEA標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍為0.1 ～ 10 ng/mL，再加入相同濃度（0.3 pg/mL）的內(nèi)標(biāo)物MT，振蕩混勻后進(jìn)行液液萃取。加入1.2 mL乙酸乙酯正己烷（9∶1， V/V），渦旋5 min，于12000 r/min下離心5 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入另一潔凈離心管中。氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇水（1∶1， V/V，0.1% 甲酸）復(fù)溶。12000 r/min離心15 min，上清液供HPLCMS/MS分析。

2.3.2 鼠腦組織 大鼠采用異氟烷麻醉，斷頭取血，冰浴分離內(nèi)側(cè)前額葉皮層（mPFC）、海馬（HF）和丘腦腹后核（VP），液氮保存，稱重（準(zhǔn)確稱至0.1 mg）。每份組織中加入0.49 mL超純水，10 μL 15 pg/mL MT，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，超聲。采用液液萃取法（見(jiàn)2.3.1節(jié)）和固相萃取法（見(jiàn)2.3.3節(jié)）兩種方法處理。

2.3.3 固相萃取方法 預(yù)先以1 mL甲醇、1 mL水活化平衡Strata C18柱。將組織勻漿液于12000 r/min下離心5 min，然后將上清液加入Strata C18柱中； 以1 mL 5%甲醇作為淋洗液，淋洗Strata C18柱。抽至近干后，以1 mL甲醇洗脫。收集洗脫液，常溫下用N2吹干。100 μL甲醇水（1∶1， V/V，0.1% 甲酸）復(fù)溶。12000 r/min離心15 min，上清液供UFLCMS/MS分析。

2.4 色譜條件

Agilent XDBC18色譜柱（ 50 mm×4.6 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫公司）。流動(dòng)相：5 mmol/L乙酸銨溶液（A）和甲醇（B）；采用梯度洗脫模式：0～2.5 min，60% B；2.5～5.5 min，60%～95% B；5.5～7.0 min，95% B；7.0～7.1 min，95%～60% B；7.1～10.0 min，60% B。流速0.5 mL/min。進(jìn)樣體積10 μL；樣品室溫度為室溫；柱溫45℃；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）模式。離子化電壓（IS）：5500 V，氣簾氣（CUR）：241.33 kPa，噴霧氣（GS1）：413.7 kPa，輔助加熱氣（GS2）：413.7 kPa，碰撞器（CAD）： Medium。由于THDOC的氨加合物物受熱容易分解，離子源溫度（TEM）設(shè)為100℃。各物質(zhì)離子對(duì)優(yōu)化后參數(shù)見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的建立

神經(jīng)甾體類化合物既可以用電噴霧離子源（ESI）電離，也可以用大氣壓化學(xué)電離源（APCI）分析[10]，本研究采用ESI正離子模式作為其離子化方式。取濃度為1.0 mg/L的各神經(jīng)甾體標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用微量蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣，一級(jí)質(zhì)譜全掃描，確定準(zhǔn)分子離子。結(jié)果顯示，6種神經(jīng)甾體均在正離子模式下獲得準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)除THDOC外， 其余5種神經(jīng)甾體以母離子為準(zhǔn)分子離子，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選豐度最高的兩個(gè)特征碎片離子作為定性定量離子，并優(yōu)化相應(yīng)離子對(duì)的去簇電壓（Declusteringpotential， DP）、碰撞能量（Collision energy， CE）、碰撞室出口電壓（Collision cell exit potential， CXP）和

3.2 液相色譜條件的選擇

3.2.1 色譜柱對(duì)分離的影響 6種甾體類激素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，如別孕烯醇酮（AP）與孕烯醇酮（PREG）分子結(jié)構(gòu)十分相近，盡管MRM方式不要求所有峰都基線分離，但分離不佳易引起共流出物之間的互相抑制。本研究分別比較了Shimpack XRODS（50 mm × 4.6 mm，2.2 μm， 島津公司）、Shimpack XRODS（100 mm×4.6 mm，2.2 μm， 島津公司）、XDBC18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm， 安捷倫公司）、Synergi Hydro RP（150 mm×2.0 mm，4 μm， 菲羅門(mén)公司）和Venusil XBP C18（ 150 mm×2.1 mm，5 μm， 安吉爾公司）5種色譜柱對(duì)6種甾體類化合物的分離效果。結(jié)果表明， XDBC18色譜柱對(duì)6種甾體類化合物的分離效果最好， 因此本研究以其為分離柱。6種甾體類化合物的保留時(shí)間見(jiàn)表1，相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式和MRM色譜圖見(jiàn)圖2。

3.2.2 流動(dòng)相對(duì)分離的影響 以XDBC18為色譜柱，考察不同流動(dòng)相對(duì)6種甾體類化合物分離的影響。分別對(duì)比了在A相和B相中加入酸或緩沖鹽時(shí)的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，A相為純水時(shí)對(duì)甾體類化合物色譜峰分離信號(hào)響應(yīng)， 優(yōu)于酸化純水（0.1% 甲酸），可能因?yàn)榧姿岣淖兞肆鲃?dòng)相的pH值，進(jìn)而影響了待測(cè)物在分析柱上的保留。在水中添加揮發(fā)性緩沖鹽乙酸銨，比較添加前后對(duì)甾體類物質(zhì)的保留時(shí)間、分離度、色譜峰形、靈敏度等的影響情況。結(jié)果表明，A相為5 mmol/L乙酸銨溶液，B相為純甲醇時(shí)，分離效果最佳。

3.2.3 柱溫對(duì)的影響 考察了柱溫箱溫度為35℃和45℃時(shí)對(duì)信號(hào)的影響，樣品是1 ng/mL混合標(biāo)樣。柱溫在45℃時(shí)待測(cè)物保留時(shí)間會(huì)縮短。對(duì)于AP，當(dāng)柱溫為35℃時(shí)，其響應(yīng)淹沒(méi)于本底噪音中；當(dāng)柱溫為45℃時(shí)，可以看到明顯的AP峰。由于神經(jīng)甾體在組織中濃度很低，儀器靈敏度是優(yōu)先考慮的問(wèn)題，因此柱溫選擇為45℃。

3.3 生物樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.3.1 液液萃?。↙LE）和固相萃?。⊿PE）的比較 液液萃取和固相萃取是生物樣品常用的兩種樣品前處理技術(shù)，兩者均有其各自的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)。液液萃取簡(jiǎn)單、廉價(jià)，但背景干擾高于固相萃取。本研究以THDOC為例，比較了兩種萃取方法對(duì)于提取鼠腦組織中的神經(jīng)甾體的效果。結(jié)果表明，液液萃取的效果明顯優(yōu)于固相萃取。而且液液萃取1次后，THDOC的響應(yīng)高于液液萃取3次，這可能是由于萃取的次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致腦組織中的雜質(zhì)也進(jìn)入到萃取液中。圖3展示了不同萃取條件下，海馬組織中THDOC的響應(yīng)情況。

3.3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 本研究為了體現(xiàn)方法的通用性和簡(jiǎn)便性，沒(méi)有采用昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)，而是選擇甲基睪丸酮（MT）作為內(nèi)標(biāo)，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。MT較同位素內(nèi)標(biāo)更為方便易得，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定，內(nèi)標(biāo)與樣品的提取回收率相近，提高了方法的精密度和準(zhǔn)確度[12]。

3.4 方法驗(yàn)證

3.4.1 線性范圍檢出限定量限 由于存在基質(zhì)效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇/水溶液中的質(zhì)譜響應(yīng)與其在生物基質(zhì)中的響應(yīng)不同，所以應(yīng)將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到空白基質(zhì)中，以制作工作曲線。而神經(jīng)甾體屬于內(nèi)源性物質(zhì)，無(wú)法得到空白基質(zhì)，于是選用5%BSA0.7% NaCl作為空白基質(zhì)[7]。配制濃度為0.1， 0.2， 0.5， 1， 2， 510 ng/mL的6種神經(jīng)甾體類化合物的溶液，按2.3節(jié)的方法處理并測(cè)定，平行測(cè)定3次。以目標(biāo)組分峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，響應(yīng)的添加含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)特征離子MRM色譜峰的信噪比大于3為檢出限，信噪比大于10為定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。6種神經(jīng)甾體激素的LODs為0.04～0.20 ng/mL，定量限LOQs確定為0.10～0.50 ng/mL。DOC和PROG在0.1～10 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，PREG，THDOC，AP和DHEA在0.5～10 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

[KH*4D][HT5”SS][HJ*4]表2 6種神經(jīng)甾體類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

去氫表雄酮 DHEAy=0.0106x+0.007460.99770.50～10 0.20[]0.50

孕酮 PROGy=0.644x+0.03690.99870.10～10 0.04[]0.10

脫氧皮質(zhì)酮 DOCy=0.402x+0.0004740.99470.10～10 0.04[]0.10

別孕烯醇酮 APy=0.365x+0.09350.99930.50～10 0.10[]0.50

孕烯醇酮 PREGy=0.0406x+0.006650.99100.50～10 0.10[]0.50

四氫脫氧皮質(zhì)酮 THDOCy=0.236x-0.01390.99930.50～10 0.20[]0.50

[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT5][HJ] 以5% BSA0.7% NaCl作為空白基質(zhì)， 考察方法的可靠性[14]。即在鼠腦組織中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，比較以鼠腦組織作為基質(zhì)和溶液作為空白基質(zhì)時(shí)工作曲線的斜率，發(fā)現(xiàn)兩者基本一致。實(shí)驗(yàn)表明，以5%BSA0.7% NaCl溶液作為空白基質(zhì)測(cè)定神經(jīng)甾體是可靠的。

3.4.2 方法的回收率與精密度 在線性范圍內(nèi)選擇3個(gè)添加水平，分別為0.4，4.0和8.0 ng/mL，按照2.3～2.5節(jié)方法平行測(cè)定6次，各化合物的平均回收率為91.2%～115.5%，RSD為0.9%～8.8%，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

3.5 實(shí)際樣品分析

利用本方法測(cè)定了成年大鼠腦組織不同分區(qū)中的6種神經(jīng)甾體的濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

4 結(jié) 論

本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）測(cè)定鼠腦組織中6種神經(jīng)甾體類激素的檢測(cè)方法。在樣品前處理過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯正己烷萃取1次效果良好；優(yōu)化了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)多種內(nèi)源性神經(jīng)甾體類激素的儀器條件；采用內(nèi)標(biāo)法同時(shí)對(duì)6種激素進(jìn)行定量分析，均獲得了較好的效果。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好，有望廣泛地應(yīng)用于生物組織中痕量甾體類激素的檢測(cè)。

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