瓊膠降解菌在衛生檢驗專業綜合實驗教學中的應用

文/林伯坤 喻玉立 邵軍麗 郭蓮仙 戴娟秀 黃明元

衛生檢驗專業是個涉及多學科知識的專業，主要包括理化檢驗和生物相關檢驗兩大方面的內容。衛生檢驗專業綜合實驗要求培養學生多學科的實驗技能，培養學生開展科學研究的思維和能力，同時提高學生的學習興趣，是基礎實驗的重要補充。因此，綜合實驗的教學內容需要滿足這些要求，尋找合適的實驗教學內容具有重要意義。一般的微生物不能利用瓊膠，因此瓊膠在微生物實驗中用作培養基載體，但是有些細菌通過產生瓊膠酶去利用降解瓊膠，這些細菌菌落在瓊膠固體培養基上形成透明降解圈，不需要碘液即可觀察，非常簡便和有趣。瓊膠降解菌的相關研究 (篩選、鑒定和酶活測定等)涉及多個學科的實驗技能，包括微生物學、生物化學和分子生物學等，有利于提高學生的綜合實驗技能，具有適合于開展綜合實驗的特點。本文根據本科生特點和知識水平，對相關的實驗教學內容進行了探討。

1.瓊膠降解菌的篩選

1.1 樣品采集

瓊膠降解菌在自然界中分布廣泛，除了海洋環境以外［1］，土壤［2－4］、河底沉積物［5］以及河水等環境中均可篩選得到瓊膠降解菌。因此，結合校園環境特點和就近原則，可選擇采集校園內或周邊環境中的土壤、湖底/河底沉積物以及河水和湖水等樣品用作瓊膠降解菌的篩選。臨近海洋的校園，也可選擇采集海洋中的海藻、海水和海底沉積物等樣品。可采樣樣品的多樣性使得可以實行分組采樣，不同組采集不同的樣品。采樣前向學生強調對采樣相關容器和工具的滅菌處理，以確保菌株來源的準確性。

1.2 菌株篩選

瓊膠降解菌的培養基會隨著樣品不同而不同。對于陸地環境樣品，一般采用普通營養肉湯培養基或者LB培養基，對于海洋環境樣品，一般采用2216E培養基。這一點內容向學生灌輸了菌株篩選應根據樣品而選擇相應的培養基的思想。

一般采取稀釋平板涂布法進行瓊膠降解菌的菌株篩選，因此需要采用相應的瓊膠固體培養基，這里的瓊膠不僅是因為用于制作固體培養基，同時也成為瓊膠降解菌的底物。瓊膠降解菌因可以產生瓊膠酶去降解瓊膠，會在瓊膠固體培養基上菌落周圍形成透明降解圈，降解圈大小代表著降解瓊膠的能力，肉眼可見，容易觀察，如果往瓊膠培養基中傾倒盧戈氏碘液，透明降解圈會更加明顯易見。容易觀察的瓊膠降解圈因此非常適合于實驗教學。

1.3 菌株的純化

挑選產生透明瓊膠圈的菌落進行純化，加強學生在固體平板劃線分離純化菌株的技能訓練，作出較美觀的劃線。

2.瓊膠降解菌的鑒定

2.1 菌株形態和細菌染色

首先觀察菌落形態和顏色，再用光學顯微鏡觀察菌體形態，最后進行革蘭氏染色試驗，加強學生的顯微觀察技能的訓練。

2.2 生理生化鑒定

選取常見的生理生化指標進行初步的鑒定，比如氧化酶、過氧化氫酶、糖類分解試驗、溶血性檢查、凝固酶試驗和抗生素抗性。條件允許情況下，可讓學生使用藥敏試驗的自動鑒定系統。

2.3 分子生物學鑒定

總DNA提取:讓學生嘗試兩種總DNA提取方法，一種是傳統的有機溶劑DNA提取法，一種是DNA提取試劑盒法。讓學生了解DNA提取試劑盒法的原理，比較兩種提取方法的優缺點。用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA的質量。

16S rRNA基因的PCR擴增:雖然實驗使用的16S rRNA基因的引物是直接購買回來的通用引物 (27F和1492R)，但仍然有必要向學生講解引物設計的原理和16S rRNA基因通用引物的設計根據。這部分內容使學生掌握PCR擴增技術、PCR產物的檢測分析以及回收純化技術。

PCR產物測序及分析:將擴增得到的PCR產物與T載體連接，轉化大腸桿菌，最終進行DNA測序。將測得的16S rRNA基因序列提交EzTaxon數據庫［6］與現有細菌的標準菌株的相關序列進行比對，或者在Genbank數據庫進行比對。根據比對結果以及菌株形態和生理生化鑒定結果確定菌株的分類歸屬。如果所獲得基因序列與數據庫序列存在差異，即可讓學生將所測基因序列提交至Genbank，將會大大提高學生的學習興趣［7］。

3.菌株的產酶檢測

將瓊膠降解菌培養在含有一定量瓊膠的液體培養基中，誘導菌株產生瓊膠酶至培養基中，通過用DNS測還原糖法測定培養液中的瓊膠酶活性，計算每毫升培養液所含的酶活單位，讓學生比較各自所篩選得到的菌株的產酶能力，既能加強學生的生物化學技能訓練，又能提高學生的學習興趣。

結論

瓊膠降解菌的相關研究 (篩選、鑒定和酶活測定等)涉及多個學科的實驗技能，包括微生物學、生物化學和分子生物學等，有利于提高學生的綜合實驗技能，且實驗條件較易滿足，實驗趣味性較好，有利于激發學生的學習興趣，具有適合于衛生檢驗專業開展綜合實驗的特點。

［1］林伯坤，陸國永，宋燕，陳鴻霖，胡忠.海洋細菌Agarivorans sp.HZ105的瓊膠降解酶系.生物技術通報，2015，31(1):160－166.

［2］陳虹，張建芬，柯薇.一株瓊膠酶產生菌的分離及產酶培養基優化.食品科技，2014，(4):10－14.

［3］韓文君，古靜燕，李天東，等.一株產瓊膠酶土壤細菌Paenibacillus sp.MY03的篩選與分子鑒定.綿陽師范學院學報，2007，26(2):86－90.

［4］Hosoda，A.，Sakai，M.Isolation of Asticcacaulis sp.SA7，a novel agar－degrading alphaproteobacterium.Biosci Biotechnol Biochem，2006，70:722－725.

［5］Rhee，Y.J.，Han，C.R.，Kim，W.C.，Jun，D.Y.，Rhee，I.K.，Kim，Y.H.Isolation of a novel freshwater agarolytic Cellvibrio sp.KY － YJ－ 3 and characterization of its extracellular β －agarase.J Microbiol Biotechnol，2010，20(10):1378 –1385.

［6］Kim，O.S.，Cho，Y.J.，Lee，K.，Yoon，S. H.，Kim，M.，Na，H.，Park，S.C.，Jeon，Y.S.，Lee，J.H.，Yi，H.，Won，S.，Chun，J.(2012).Introducing EzTaxon:a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.Int J Syst Evol Microbiol 62，716–721.

［7］侯進慧.從淀粉酶產生菌篩選和基本鑒定談探究性實驗教學.微生物學通報，2010，37(1):127－129.