Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化側(cè)柏葉總黃酮提取工藝

丘思蘭，譚志燦，黃潔靖，利創(chuàng)華2，

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東廣州510700；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405；3.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校，廣東廣州510430）

側(cè)柏葉，別名柏葉、扁柏葉、叢柏葉，為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥枝梢和葉。一般在夏、秋二季采收，陰干，我國(guó)大部分地區(qū)均有產(chǎn)。側(cè)柏葉味苦、澀，性寒。歸肺、肝、脾經(jīng)。具有涼血止血，化痰止咳，生發(fā)烏發(fā)的作用。用于吐血，衄血，咯血，便血，崩漏下血，肺熱咳嗽，血熱脫發(fā)，須發(fā)早白等癥[1]。

側(cè)柏葉主要含有黃酮類化合物、揮發(fā)油、鞣質(zhì)等成分[2-4]。現(xiàn)代藥理研究表明，側(cè)柏葉具有抑菌、止血、抗腫瘤、抗炎、抗紅細(xì)胞氧化等作用[5-9]。側(cè)柏葉的主要藥效成分為黃酮類化合物。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 效應(yīng)面法對(duì)側(cè)柏葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，為充分發(fā)揮其藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

SP-756PC 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；HH-8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市成輝儀器廠）；AL104 型電子分析天平（上海梅特勒托利多儀器有限公司）。

側(cè)柏葉藥材購(gòu)自廣東和翔制藥有限公司（批號(hào)20140203），經(jīng)鑒定為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥枝梢和葉；槲皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111538-200504）；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 側(cè)柏葉總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對(duì)照品12.05mg，置25mL 量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。含槲皮苷0.482mg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取側(cè)柏葉藥材粉末1g，置50mL 圓底燒瓶中，加石油醚25mL，回流脫脂兩次，每次2h，取藥渣干燥，并按照表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備供試品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取上述槲皮苷對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分別置25mL 量瓶中，加乙醇至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉溶液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅤA），在最大吸收波長(zhǎng)500nm 處測(cè)定其吸光度A，以吸收度A 為縱坐標(biāo)，濃度C 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=14.070 3C－0.003 3，r=0.999 7，線性范圍為0.009 64～0.057 84mg/mL。

2.1.4 樣品測(cè)定

精密量取供試品溶液0.5mL，置25mL 量瓶中，照“2.1.3”項(xiàng)下的方法，自“加乙醇至6mL”起依法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

2.2 Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)選最佳提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用回流提取法，固定提取數(shù)為2 次，提取溫度85℃，選取乙醇濃度、溶劑體積、提取時(shí)間為考察因素，以側(cè)柏葉總黃酮的提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表1。0.01），乙醇濃度的二次項(xiàng)對(duì)側(cè)柏葉總黃酮提取率達(dá)顯著水平（P＜0.05）。采用Design Expert 軟件作出相應(yīng)的等高線圖和效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖1-6。

表1 側(cè)柏葉總黃酮的提取工藝優(yōu)選Box-Behnken試驗(yàn)安排及結(jié)果

表2 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

利用ANOVA 分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。采用Design Expert 7.0.0 軟件對(duì)表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y = - 2.733 29 + 0.031 120A + 0.094 271B +0.057 861C + 2.500 00×10-4AB - 1.111 11×10-5AC -4.166 67×10-5BC-2.259 26×10-4A2-3.489 58×10-3B2-3.259 26×10-4C2（相關(guān)系數(shù)R2=0.984 7，變異系數(shù)C.V.為1.61%）

結(jié)果表明，該模型擬合度良好。

表2 為回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析。乙醇濃度的一次項(xiàng)，溶劑體積、提取時(shí)間的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)側(cè)柏葉總黃酮提取率達(dá)極顯著水平（P＜

圖1 因素A 和因素B 對(duì)響應(yīng)值Y 的等高線圖

圖2 因素A 和因素B 對(duì)響應(yīng)值Y 的效應(yīng)面圖

圖3 因素A 和因素C 對(duì)響應(yīng)值Y 的等高線圖

圖4 因素A 和因素C 對(duì)響應(yīng)值Y 的效應(yīng)面圖

圖5 因素B 和因素C 對(duì)響應(yīng)值Y 的等高線圖

圖6 因素B 和因素C 對(duì)響應(yīng)值Y 的效應(yīng)面圖

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由二次多項(xiàng)式回歸模型得出最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度75.44%，溶劑體積15.70 倍，提取時(shí)間86.46min。在此條件下，側(cè)柏葉總黃酮理論提取率為1.681 9%. 對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總黃酮平均提取率1.6728%（RSD=0.902%）. 表明所優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性良好。

3 討論

目前，提取工藝的優(yōu)選多采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)，雖然試驗(yàn)次數(shù)少，但結(jié)果精度低。在給出的整個(gè)區(qū)域內(nèi)，不能找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。Box-Behnken 效應(yīng)面法采用多元二次方程，擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 效應(yīng)面法，考察乙醇濃度、溶劑體積、提取時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)側(cè)柏葉總黃酮提取率的影響。方差分析結(jié)果可見(jiàn)，3 個(gè)因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均具有顯著性，3 個(gè)因素之間的乘積項(xiàng)均無(wú)顯著性，表明各因素之間的相互作用較小。二次多項(xiàng)式回歸模型可以達(dá)到極顯著水平，且失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，最終確定最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度75.44%，溶劑體積15.70倍，提取時(shí)間86.46min。本實(shí)驗(yàn)為充分發(fā)揮側(cè)柏葉藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為效應(yīng)面法在中藥提取工藝的應(yīng)用提供示范性研究。

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