膜迷路積水動物模型造模方法的研究進展*

陳茜茜，蔣麗元，陳華德

（浙江中醫藥大學，浙江杭州310053）

梅尼埃病（Meniere’s disease，MD）是以反復發作性、自發性、陣發性眩暈，聽力損失，耳悶、耳鳴等為主要臨床表現的特發性膜迷路積水綜合征。1861年法國醫生首次報道了梅尼埃病，Hallpike 等[1]最先提出了梅尼埃病病人的病理改變為膜迷路積水。后來人們逐漸認識到，膜迷路積水是許多內耳疾病相同的病理改變，而MD 僅為其中的一種。鑒于人耳的特殊性，很多實驗只能靠建立動物模型來進行，因此，動物模型的制作在梅尼埃病的研究中占據了很重要的地位。本文將目前膜迷路積水動物模型的造模方法及特點等綜述如下。

1 手術法

Kimura 等[2]通過手術來阻塞豚鼠內淋巴管和破壞內淋巴囊，首次成功在豚鼠體內復制出了膜迷路積水的動物模型。Konishi[3]在此基礎上，創立了后顱窩硬膜外進路法，此法只破壞了部分骨內淋巴囊和淋巴導管，對枕骨破壞小，也減少了對硬腦膜和乙狀竇的刺激，存活率也較之前高。Dunnebier[4]探索出了一種不破壞前庭導水管的新方法。具體方法為：模型分為2 組，第1 組分離乙狀竇和遠端淋巴囊，其間填充明膠海綿；第2 組用硝酸銀燒灼附于乙狀竇骨外的淋巴囊，不填充任何物質。手術23d 后取材，觀察到第1 組大部分豚鼠中度到重度積水，部分輕度積水，最嚴重的部位在頂轉，其次是底轉；第2 組部分輕度積水。Dunnebier 認為，內淋巴囊對于淋巴液的吸收是雙向的。所以使淋巴囊和乙狀竇完全分離是制作MD 模型更好的手術方法，能使我們更好地觀察MD 的病理生理學，從而也證明了骨內的淋巴囊在調理膜迷路積水中起著重要的作用。

手術方法制作MD 模型成功率高，但是難度大，操作技術要求嚴格，動物易感染致死。

2 內分泌調節法

有研究發現MD 患者血清中抗利尿激素（ADH）水平在病情發作時明顯高于正常人[5]，說明ADH 在MD 的致病機理中起著一定的作用。Kumagami 等[6]認為，血管加壓素（AVP）對膜迷路積水的影響是通過內淋巴囊對內淋巴液的重吸收實現的。其實驗方法如下：通過對豚鼠腹腔注射血管加壓素，0.5 單位/g·d-1，連續注射60d，制作出了慢性膜迷路積水模型，成功率為70%，其中30%中輕度積水，40%重度積水，并指出：內淋巴囊可能是AVP依賴調節的靶器官，在內淋巴囊中可能存在AVPV2R-cAMP-AQP2 通道，AVP 在內耳通過作用于淋巴囊上皮細胞，減少內淋巴囊對淋巴液重吸收而引起膜迷路積水。

醋酸去氨加壓素是ADH 的類似物，邢巍巍等[7]通過腹腔注射醋酸去氨加壓素的方法制備豚鼠膜迷路積水模型，4μg/kg·d-1，連續注射1 周。1 周后觀察到部分豚鼠有水平性眼震，但時間無特定性，第3周部分豚鼠出現走路蹣跚，ABR 閾值較對照組升高。耳蝸組織切片觀察到了40%中度積水，60%重度積水，積水程度從頂轉到底轉逐步加重，部分前庭膜有破裂，AQP-2 在蝸管外側壁、螺旋神經節及Corti 氏器等處表達增加。該方法操作簡單，模型成功率較腹腔注射血管加壓素高，但是在模擬MD 的臨床表現方面仍較差。

蔣子棟等[8]在Dunnebier[9]兩期法的啟發下，發現單純腹腔注射醛固酮也可以制做出膜迷路積水的模型。具體方法如下：豚鼠腹腔注射醛固酮，0.1mg/kg.d-1，連續注射5d。觀察到1 個月后開始出現輕度積水，并隨時間變長而加重，從底轉開始，2個月之內發展成了中度和重度，ABR 閾值較實驗前明顯提高。

3 透明質酸凝膠蝸頂注射法

Salt 等[10]通過豚鼠耳蝸頂轉注射透明質酸凝膠的方法來誘導膜迷路積水模型，觀察到傳感位點的持續性變化，Corti’s 器向鼓階移動，而耳蝸內電位和復合動作電位的變化與Corti’s 器的移位相一致。并推測可能的原因為：在注射過程中，鼓階底轉產生的壓力使前庭階和外淋巴液之間產生了微小的壓力差而使凝膠從鼓階滲透到耳蝸導水管，引起Corti’s 器向鼓階的移動。該方法誘導的膜迷路積水可以模擬出Corti’s 器持續性向鼓階凸出的病理改變，耳蝸內部的電位變化也有助于解釋MD 患者對外界低頻壓力改變的敏感性。

4 人工淋巴液注射法

通過向鼓膜直接注射人工淋巴液是誘導膜迷路積水最直接最快速的方法。Kakigi 等[11]觀察到，往豚鼠鼓膜內連續注入淋巴液大于3μL 時，外淋巴液中鉀離子的濃度明顯升高，并認為這是MD 病患者前庭功能障礙的原因之一。Brown 等[12]通過微管在豚鼠內耳蝸中階緩慢注入人工淋巴液，觀察到復合動作電位的閾值升高，基底膜向鼓階移動；通過向橢圓囊注入人工淋巴液，觀察到前庭誘發動作電位的降低，瞬時敏感性增加。而耳蝸內電位變化隨著注射速度的快慢具有明顯的波動性。這有助于解釋MD 患者波動性的病情變化。

5 噪聲暴露法

Salt[13]將豚鼠置于200Hz 的低頻噪聲環境中，給聲強度為115dB SPL，3min 后觀察到，膜迷路積水約增加30%，并在暴露結束后數分鐘恢復，造成了快速的暫時性的聽力損傷和膜迷路積水。屈立新等[14]將豚鼠置于4kHz 的窄帶噪聲環境中，給聲強度為120dB SPL，刺激時間為4h，觀察到ABR 閾值明顯升高后，Caspse-12 蛋白含量在噪聲刺激后迅速增高，耳蝸螺旋神經元細胞（SGC）不同程度地凋亡，并指出Caspase-12 活化介導內質網應激參與噪聲引起耳蝸SGC 凋亡的過程，能造成模型永久性的聽力損失。噪聲暴露法能快速建立有效的膜迷路積水動物模型，但該方法誘導產生的積水并不穩定。

6 免疫法

Watanabe 等[15]用KLH 誘導膜迷路積水動物模型，先通過全身KLH 致敏，2 周后再次加強免疫，之后將KLH 注入內淋巴囊行局部免疫，觀察到Reissner’s 膜不同程度地凸向前庭階，檢測到了從底轉到頂轉的一氧化氮合酶（iNOS）免疫反應，并提出假設：iNOS 合酶在膜迷路積水中起著調節作用。通過免疫法誘導膜迷路積水發生率較高，能模擬出MD的病理改變，但造模后模型不穩定，觀察周期較長，實驗研究較少用。

7 綜合法

Segenhout 等[16]利用兩期法的原理，先分離豚鼠左耳遠端的淋巴囊，之后腹腔注射注射醛固酮，100μg/g·d-1，連續注射5d，成功制備聽力損傷的膜迷路積水動物模型。Dunnebier 和Segenhout[17]再一次通過實驗驗證了此制作方法的優越性。該方法的優點在于，很接近MD 患者波動性的聽力變化。手術誘導產生的膜迷路積水主要引起頂轉低頻聽力的下降，醛固酮主要引起底轉高頻聽力的下降，是較為理想的模型。

Kim 等[18]通過腹腔注射醛固酮聯合鼓室注入脂多糖（LPS）的方法來誘導膜迷路積水的動物模型。其方法具體如下：腹腔注射醛固酮100μg/100g·d-1，與此同時，通過左耳鼓膜將脂多糖注入到左鼓室，1mg/d，連續注射5d。耳蝸切片結果顯示，耳蝸輕度到中度的水腫，在血管紋處壓力滲透蛋白94（OSP94）顯著提高，但是仍然沒有模擬出前庭神經功能紊亂的臨床癥狀。

8 Phex 基因鼠模型

這種模型為PhexHyp 和PhexGy，即位于X 線染色體[19-20]上的具有造成同源性肽酶的磷酸調節功能喪失的基因模型。但是雄性PhexGy 鼠不育，從而失去了其作為研究工具的有用性。Lorenz 等[21]報道了一種新的動物模型，PhexHyp-Duk，該種小鼠會表現出盤旋等前庭功能損害的征象，包括前庭中階的腫大和聽力的損失，并隨年齡增長積水程度逐漸加重。Megerian 等[22]指出，該種小鼠在出生后會出現自發性的內耳功能損害，包括盤旋，頭上下搖動，步態不穩，該表現在出生后15d 即開始出現，到30d 的時表現已經非常明顯。該模型可以作為一個較理想的模型來研究MD，因為它并不需要手術干預。

Ichikawa 等[23]發現，Phex 基因的突變量可能會對礦物離子的代謝產生影響。從而影響其對細胞外磷酸鹽濃度的設置點。Semaan 等[24]提出假說，PhexHyp-Duk 鼠產后膜迷路積水進行性惡化的機制可能與內耳螺旋神經元細胞凋亡有關。Wick 等[25]在總結該鼠模型時指出，Phex 基因鼠模型膜迷路積水的發展并不是完全由于基因的缺失，而且該模型內耳螺旋神經元細胞的死亡先于內耳聽細胞，所以觀察內耳螺旋神經元細胞的凋亡變性，實時性的病理診斷，以及未來神經元的保護治療可能會成為以后研究MD 的新著手點。

9 總結與展望

綜上所述，誘導膜迷路積水的動物模型方法各異，原理也各不同，但都存在自己的局限性，而且造模后對模型的臨床表現的觀察時間都偏短，雖幾經改進，但MD 的臨床癥狀模擬仍未到達很理想的狀態。盡管如此，這些造模方法還是對MD 的病因病理以及發病機制的研究帶來了很大的促進作用。近幾年發展起來的的Phex 鼠膜迷路積水動物模型作為MD 的研究雖較為理想，但是因為基因缺失而帶來的對于模型本身其它方面影響仍需要做進一步的研究。

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