疏肝理氣、化濕活血法對(duì)胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞FGF-21 水平及其受體表達(dá)的影響

龍 艷，孫 璐，范冠杰

（1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州510080；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120）

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制之一，它表現(xiàn)為胰島素的靶器官或靶組織（肝臟、肌肉、脂肪組織、胰島β 細(xì)胞本身）對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低，多認(rèn)為其機(jī)制與胰島素受體或受體后缺陷導(dǎo)致胰島素的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有關(guān)[1]。改善IR、提高機(jī)體的胰島素敏感性是治療糖尿病尤其是早期糖尿病的關(guān)鍵。越來(lái)越多的研究表明，人體多種細(xì)胞因子參與了胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過程[2]，其中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-21）具有不依賴于胰島素分泌的獨(dú)立的糖-脂代謝調(diào)控作用，它通過與FGF 受體（FGFRs）結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮增強(qiáng)胰島素敏感性的作用[3-6]。有研究證實(shí)，疏肝理氣、化濕活血法具有改善胰島素抵抗作用[7-8]。因此，本研究選取小鼠脂肪細(xì)胞3T3-L1 為研究對(duì)象，探討疏肝理氣、化濕活血法中藥對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用及其與FGF 信號(hào)通路之間的關(guān)系，現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。成年雄性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量180～220g，SPF 級(jí)，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）20050020。

1.2 主要儀器與試劑

胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；油紅O、地塞米松、重組人胰島素購(gòu)自美國(guó)sigma 公司；葡萄糖檢測(cè)分析試劑盒II（美國(guó)Biovision 公司），鼠FGF-21 ELISA 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)millipore公司），熒光定量PCR 混合液（日本TOYOBO 公司）、寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸Oligo（dT）15（primer 公司）；脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP mix）、隨機(jī)引物、RNasin 核酸酶抑制劑、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。CKX41 倒置光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），HERACELL150i 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司），DMI6000B 倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司），D3 核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)Eppendorf），ABI 7700 核酸序列檢測(cè)儀（美國(guó)ABI 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品及含藥血清的制備

中藥方劑組成：柴胡10g，白芍15g，薄荷5g（后下），牡丹皮15g，蒼術(shù)10g，黃柏10g，薏苡仁30g，綿茵陳30g，車前草30g，丹參15g，莪術(shù)10g，澤蘭15g，甘草5g。蒸餾水翻煎3 遍，過濾、濃縮，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浜幯澹簩⒊赡晷坌許D 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥組及西藥吡格列酮組，每組4 只。按體表面積折算法將藥品折算成大鼠等效劑量的10 倍灌胃給藥（中藥216g/kg.d-1，西藥4.05mg/kg），對(duì)照組予灌胃相同體積蒸餾水，2 次/d，連續(xù)5d，末次灌胃后3h，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，低溫離心3000r/min×20min，取上層血清以0.22μm 濾膜過濾除菌，凍存管分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

參照Anil Kumar[9]報(bào)道的方法對(duì)前脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化。將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞按5×104/mL 密度接種于6 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合約達(dá)80%，將培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基1（10%胎牛DMEM 高糖培養(yǎng)基，含0.5mmol/L IBMX、0.25μmol/L 地塞米松、0.26IU/mL 胰島素）處理48h，然后換以誘導(dǎo)培養(yǎng)基2（10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，含0.26IU/mL人胰島素） 處理48h，再換用10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，每2d 換液1 次。在倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形狀，培養(yǎng)8d 后，約90%以上細(xì)胞呈現(xiàn)成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)，即可開始下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 胰島素抵抗細(xì)胞模型的復(fù)制及分組給藥

參照文獻(xiàn)[10]方法建立胰島素抵抗模型。將分化成熟的脂肪細(xì)胞以無(wú)血清的低糖（5.5mmol/L）DMEM 培養(yǎng)基同步化24h，再換以含1μmol/L 地塞米松的完全培養(yǎng)基孵育48h，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中葡萄糖含量，以未接種細(xì)胞的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算葡萄糖消耗量，用來(lái)評(píng)估細(xì)胞模型。造模成功后予換液，同時(shí)將細(xì)胞隨機(jī)分為以下5 組：A、正常組：正常脂肪細(xì)胞，以含10%胎牛血清＋10%正常大鼠血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；B、模型組：胰島素抵抗脂肪細(xì)胞，以含10%胎牛血清＋10%正常大鼠血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；C、吡格列酮組：胰島素抵抗脂肪細(xì)胞，以含10%胎牛血清＋10%吡格列酮大鼠血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；D、中藥高劑量組：胰島素抵抗脂肪細(xì)胞，添加含10%胎牛血清＋10%中藥大鼠血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；E、中藥低劑量組：胰島素抵抗脂肪細(xì)胞，添加含10%胎牛血清＋5%中藥大鼠血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)試驗(yàn)3 次。分組的同時(shí)設(shè)立未接種細(xì)胞的空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照。以上藥物處理的濃度及時(shí)間均根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而確定。

1.6 葡萄糖消耗量及FGF-21 水平測(cè)定

分別在中藥含藥血清處理后第24h、48h，吸取細(xì)胞上清液，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各孔培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將所得各孔葡萄糖濃度與未接種細(xì)胞的空白DMEM 高糖培養(yǎng)基孔的葡萄糖濃度相減，算出葡萄糖消耗量。同時(shí)，采用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中FGF-21 濃度。

1.7 引物設(shè)計(jì)及FGFR1、FGFR2 基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

參照Genebank 中提供的小鼠FGFR1、FGFR2和GAPDH 的mRNA 序列，應(yīng)用primer5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。內(nèi)參GAPDH 引物序列：正義鏈5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3’，反義鏈5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3’，PCR 產(chǎn)物141bp。目的基因FGFR1引物序列：正義鏈5’-TTATCCTGGGCGTGTGAAAA -3’， 反 義 鏈5’-CCAATGCATCGGGAGATAGA-3’，PCR 產(chǎn)物160bp。目的基因FGFR2 引物序列：正義鏈5’-CTTCTGCCCGGGTTACACAT-3’，反義鏈5’-CCGAATGATGCTGGGCTTT-3’，PCR產(chǎn)物140bp。細(xì)胞經(jīng)分組藥物處理48h 后，采用Trizol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)FGFR1 和FGFR2基因相對(duì)表達(dá)量水平。PCR 循環(huán)參數(shù)：95℃10min→95℃15s→60℃30s→72℃32s，讀板，共40 個(gè)循環(huán)。

1.8 表達(dá)差異的計(jì)算方法

用2-ΔΔct值表示基因相對(duì)表達(dá)量。通過軟件計(jì)算出所有樣本內(nèi)參照和目的基因的循環(huán)閾值Ct值，再計(jì)算ΔCt＝（目的基因Ct－內(nèi)參Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后再計(jì)算ΔΔCt＝（待測(cè)樣品中目的基因ΔCt－參照樣品中目的基因ΔCt）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（若無(wú)參照樣品則選擇Ct 最大的樣品為參照進(jìn)行計(jì)算），最后基因相對(duì)表達(dá)量＝（2-ΔΔct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用stata11.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，方差齊者，采用t 檢驗(yàn)，方差不齊或非正態(tài)性分布資料采用秩和檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Bonfferoni 法，方差不齊者或小樣本資料則采用H 檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的分化及鑒定

于倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，分化前的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞呈梭型、不規(guī)則形狀，胞質(zhì)內(nèi)少量脂滴；隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形狀逐漸變圓，胞質(zhì)內(nèi)脂滴逐漸增多，可見部分大脂滴；誘導(dǎo)分化第8 天，大部分細(xì)胞呈橢圓形或圓形，脂滴逐漸匯合，并聚集于核周，形成典型的“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)；經(jīng)油紅“O”染色后，可見90%以上細(xì)胞胞質(zhì)可特異性著橘紅色，提示細(xì)胞已分化為成熟脂肪細(xì)胞（見圖1）。

圖1 3T3-L1 細(xì)胞分化前（A）和分化成熟后（B）形態(tài)（×200）

2.2 脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)48h 后，所有細(xì)胞上清液的葡萄糖濃度均較未接種細(xì)胞的空白培養(yǎng)基孔下降，提示葡萄糖在細(xì)胞培養(yǎng)過程中逐漸消耗。以添加1μmol/L 地塞米松共培養(yǎng)的細(xì)胞為模型組細(xì)胞，同時(shí)以未添加地塞米松的細(xì)胞作為對(duì)照組，孵育48h后，模型組細(xì)胞上清中葡萄糖消耗量較對(duì)照組低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示1μmol/L 地塞米松培養(yǎng)48h 可抑制脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗，可作為胰島素抵抗細(xì)胞模型（表1）。

表1 1μmol/L 地塞米松培養(yǎng)48h 細(xì)胞葡萄糖消耗量（x±s）

2.3 疏肝理氣、化濕活血法對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

由表2 可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞上清液中葡萄糖濃度逐漸下降，提示葡萄糖消耗量逐漸增加。模型對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h 后葡萄糖消耗量均低于同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組（P＜0.01）。添加吡格列酮及中藥含藥血清處理24h 及48h 后，各組細(xì)胞上清液中葡萄糖消耗量有不同程度的升高，與同時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。但培養(yǎng)48h 后兩個(gè)中藥劑量組均較吡格列酮組葡萄糖消耗量低（P＜0.01）。中藥不同劑量組在2個(gè)時(shí)段的葡萄糖消耗量無(wú)明顯差別（P>0.05）。

表2 各組葡萄糖消耗量（x±s，mmol/L）

2.4 疏肝理氣、化濕活血法對(duì)脂肪細(xì)胞上清液FGF-21 水平的影響

由表3 可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，模型對(duì)照組細(xì)胞上清液中FGF-21 濃度逐漸升高，培養(yǎng)24h、48h 后均高于正常對(duì)照組（P＜0.01），給予中藥或吡格列酮含藥血清處理24h、48h 后FGF-21 濃度均有所下降，與同時(shí)段模型對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中吡格列酮組FGF-21 濃度較2 個(gè)中藥劑量組下降更為明顯（P＜0.01），而中藥高劑量組則較低劑量組下降明顯（P＜0.01）。

表3 各組脂肪細(xì)胞上清液FGF-21 水平（x±s，pg/mL）

2.5 疏肝理氣、化濕活血法對(duì)脂肪細(xì)胞FGFR1 及FGFR2 基因表達(dá)的影響

FGFR1、FGFR2 及GAPDH 的擴(kuò)增曲線平滑，熔解曲線呈特異性單峰，提示PCR 檢測(cè)敏感性和特異性較好（圖2）。由表4 可見，細(xì)胞培養(yǎng)48h 后，模型對(duì)照組較正常對(duì)照組FGFR1 相對(duì)表達(dá)量有所下降，予以中藥或吡格列酮含藥血清處理后均有所回升，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，吡格列酮組FGFR1 表達(dá)量與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但2 個(gè)中藥劑量組FGFR1 表達(dá)量與模型對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。模型對(duì)照組FGFR2 基因相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），經(jīng)中藥高劑量或吡格列酮含藥血清處理48h 后其表達(dá)量有所回升，與模型對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），吡格列酮組較中藥組FGFR2 表達(dá)量回升更為顯著，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖2 各基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖

表4 各組FGFR1 及FGFR2 基因相對(duì)表達(dá)量（x±s）

3 討論

IR 是2 型糖尿病和代謝綜合征的典型特征，也是諸多心血管疾病的危險(xiǎn)因素[11]。脂肪組織在IR 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]，它主要通過分泌多種脂肪細(xì)胞因子，干擾正常的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IR 的發(fā)生[13]。FGF-21 是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞因子，是FGFs 超家族成員之一，主要在肝臟、脂肪組織、胰腺中表達(dá)[14-15]。FGF-21 是一個(gè)重要的代謝調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)FGF-21 可增強(qiáng)小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞和人類前脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，肝臟過表達(dá)FGF-21 的轉(zhuǎn)基因小鼠其胰島素敏感性和葡萄糖清除率增強(qiáng)，血清甘油三酯濃度降低，給該小鼠喂食高脂肪飲食后可明顯抑制體重增加；同時(shí)該研究小組發(fā)現(xiàn)，給肥胖、胰島素抵抗小鼠（ob/ob或db/db）或肥胖Zucker 糖尿病大鼠注射重組FGF-21 后可降低其血糖及血胰島素水平[3]。人體研究觀察到T2DM 患者FGF-21 水平明顯高于正常對(duì)照組，而且FGF-21 水平與胰島素敏感性負(fù)相關(guān)，而與胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、血糖及糖化血紅蛋白水平（HBA1c）正相關(guān)[16]。FGF-2I 主要通過經(jīng)典的FGF 受體（FGFRs）起作用，它可誘導(dǎo)FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3 酪氨酸磷酸化[17-18]，并進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)ERKI/2 及Akt 等信號(hào)途徑，發(fā)揮其糖脂代謝調(diào)節(jié)作用[19]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 患者經(jīng)PPAR-γ 激動(dòng)劑降糖治療后，血漿FGF-21 水平較治療前明顯降低了，提示FGF-21 可能通過PPARγ 途徑發(fā)揮其生理作用[20]。

肝氣郁滯兼有濕濁、血瘀是糖尿病較為常見的復(fù)雜病機(jī)之一。尤怡《金匱要略心典·消渴小便利淋病脈證并治第十三》云：“夫厥陰風(fēng)木之氣，能生陽(yáng)火而爍陰津，津虛火實(shí)，臟燥無(wú)液，求救于水，則為消渴。”肝失疏泄，肝木乘脾，致脾虛運(yùn)化失職，痰濕內(nèi)生；而肝氣不暢，痰濕內(nèi)阻，日久可致血行遲澀，血脈瘀阻。現(xiàn)代研究也表明，疏肝解郁、健脾化濕活血等治法能改善胰島素抵抗[7-8]。

因此，針對(duì)肝氣郁滯兼夾濕濁、血瘀的復(fù)雜病機(jī)，運(yùn)用疏肝理氣、化濕活血法，觀察相應(yīng)的方劑對(duì)3T3-L1 細(xì)胞IR 的改善作用并探討其作用機(jī)制，具有一定的理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明，疏肝理氣、化濕活血法可明顯增加3T3-L1 細(xì)胞葡萄糖消耗量，減輕IR，并使得IR 狀態(tài)下升高的FGF-21 水平降低，使FGFR2 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)。在IR 狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞FGFR2 表達(dá)水平明顯下降，而FGF-21 水平反而升高，考慮與細(xì)胞代償機(jī)制有關(guān)[21]。經(jīng)中藥處理后，細(xì)胞FGF-21 水平降低，其原因可能與胰島素抵抗改善后細(xì)胞所需FGF-21 減少，F(xiàn)GF-21 水平反饋性降低有關(guān)，這與國(guó)外研究報(bào)道一致[16，22]。而疏肝理氣、化濕活血法在改善3T3-L1 細(xì)胞IR 的同時(shí)能顯著升高細(xì)胞FGFR2 表達(dá)量，推測(cè)這將有可能使得FGF-21 能與更多的FGFR2 相結(jié)合，從而激活FGF 信號(hào)途徑，增強(qiáng)FGF-21 調(diào)節(jié)糖代謝的活性，但其具體的作用途徑尚待進(jìn)一步的分子研究證實(shí)。

綜上所述，疏肝理氣、化濕活血法能顯著改善3T3-L1 脂肪細(xì)胞IR 水平，其機(jī)制可能與FGF 信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究為中醫(yī)藥防治糖尿病提供了一定的研究思路。但該作用機(jī)制與體內(nèi)胰島素分泌的相互作用關(guān)系如何，對(duì)FGF 受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響如何，以及中藥藥串的具體有效成分是什么，這些問題尚待在今后的研究工作中進(jìn)一步探討。

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