高效石油降解菌的篩選及在石油污水處理中的應用

黃敏剛 付瑞敏 谷亞楠 郭彥釗 陳五嶺

摘要：分別從新疆油田、大慶油田的原油中分離得到高效石油降解菌2株，分別編號L-1和D-2，對菌株進行形態學、生理生化及分子生物學分析，而后將L-1和D-2等比例形成微生物復合菌劑，測定復合菌劑對不同濃度和不同性質原油的降解率，并將該復合菌劑初步應用于石油污水的處理中。經鑒定，這兩株菌分別為多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）和動膠菌（Zoogloea oryzae）。復合菌劑的最適接種量為9%、最適處理時間為72 h、最適pH 7.5，在該條件下，可將污水的含油量降低85%。因此，這兩株高效石油降解菌在石油污水的處理中具有巨大的應用潛力。

關鍵詞：石油降解菌；原油；石油污水；水處理

中圖分類號：Q93-331；X741 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3104-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.009

Screening on Highly Efficient Oil-degrading Bacteria and Their Application

in Oil Sewage Disposal

HUANG Min-gang1， FU Rui-min1，2， GU Ya-nan1， GUO Yan-zhao1， CHEN Wu-ling1

（1.College of Life Science， Northwest University， Xi'an 710069， China； 2.Henan Institute of Education， Zhengzhou 450046， China）

Abstract： Two strains（L-1，D-2），which can degrade petroleum， were isolated from crude oil of Xinjiang oilfield and Daqing oilfield respectively. After the morphological， physiological， biochemical and molecular analysis， the two strains were identified and mixed together in equal proportion to form the microbial agents. Then， the microbial degradation rates of crude oil with different concentration and properties were tested. After that， the microbial agents were preliminarily applied to crude oil sewage disposal. As was shown in the results， the strains（L-1，D-2）were identified as Sphingobacterium multivorum and zoogloea oryzae respectively. The optimal inoculating concentration of the microbial agents was 9%， the optimal processing time was 6 h， and optimal pH was 7.5.Under that condition， the removal rate of crude oil could reach 85%. Therefore， the two oil-degrading bacterium were considered to have great utilization potentials on oil sewage disposal.

Key words：oil-degrading bacteria； crude oil； oil sewage； water disposal

石油是由多種烴類組成的復雜混合物，含有少量硫、氮、氧等化學元素和微量金屬[1]。石油中的烴類化合物包括從甲烷到相對分子質量1 500～2 000的烴類，主要包括烷烴、環烷烴及芳香烴，約占石油含量的50%～80%，其中烷烴是石油中的主要成分，碳原子數在1～40不等，其中以6～8個碳原子數的烷烴在石油中含量較高。目前，油井產物中的含水量遠大于含油量，油田綜合含水率達90%以上[2]。石油污水的超標排放對水體環境和自然生態環境造成嚴重危害。石油污水中石油的存在形態分為4種：浮油、分散油、乳化油、溶解油。其中，浮油和分散油可以靜置一段時間從石油污水中分離出來，乳化油和溶解油可以穩定分散于石油污水中，采用一般方法很難去除[3，4]。利用微生物分布廣、繁殖快以及可以徹底降解污染物和不產生二次污染來處理石油污水被視為一項應用前景廣闊的石油污水處理技術[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 原油樣品分別取自新疆油田和大慶油田的原油，原油的性質見表1。

1.1.2 培養基 富集培養基：NaCl 10 g，NH4Cl 1.5 g，K2HP04 0.5 g，MgS04 0.5 g，CaCl2 0.2 g，KCl 0.1 g，FeS04·7H20 0.02 g，5 mL表面活性劑，去離子水1 000 mL，pH 7.0；

分離和斜面保存培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20～30 g，滅菌過的原油1%，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2；

液體發酵培養基：NaCl 10 g，NH4Cl 1.5 g，K2HP04 0.5 g，MgS04 0.5 g，CaCl2 0.02 g，KCl 0.1 g，FeS04·7H20 0.02 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0，滅菌過的原油酌情添加。

1.1.3 石油污水 石油污水取自某油田某采油廠，水質如表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與篩選 分別將新疆油田和大慶油田滅菌過的10 g原油樣品加入到200 mL的富集培養基中，溫度35 ℃、150 r/min的搖床中培養7 d，通過稀釋涂平板法篩選分離出石油降解菌[6]。從大慶油田分離得到的菌株編號為D-1～D-6，從新疆油田分離得到的菌株編號為L-1～L-7。

將分離得到的菌株制成菌懸液，取1 mL菌懸液接種到100 mL含石油濃度為4 g/L的液體發酵培養基中，在搖床上培養，轉速為150 r/min，溫度35 ℃，培養5 d之后采用GC分析法[7]測定培養液中的原油殘余量，每個處理3個重復，對照組為不接菌的原油濃度為4 g/L的液體發酵培養基，計算其平均降解率，篩選出高效降解菌株。

將篩選出的高效石油降解菌在LB平板上交叉劃線，檢驗菌株間是否存在拮抗作用。

1.2.2 菌株形態觀察及生理生化反應 將篩選所確定的菌株，在LB平板上劃線，32 ℃分別培養24 h，革蘭氏染色觀察菌株的個體形態，觀察菌落形態，生理生化反應[8]。

1.2.3 菌株的分子生物學鑒定 參照前人方法[9]，采用上海生工提供的試劑盒提取所選菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA的PCR擴增引物采用通用引物（27F：5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），該引物合成自上海生工。PCR反應參數（94 ℃，5 min； 94 ℃，50 s→50 ℃，50 s→72 ℃，90 s，共計30個循環；72 ℃，10 min）。由上海生工將所得PCR產物回收純化并對目的片段進行基因測序，所得序列采用MEGA3.0同NCBI上的相近物種的16S rDNA序列構建系統發育樹，樹的聚類穩定性進行1 000次自導檢驗[10]。

1.2.4 石油降解菌對原油的降解試驗

1）不同含油量對降解效果的影響。原油降解試驗中液體發酵培養基和原油樣品分開滅菌，改變液體發酵培養基中石油的添加量，使濃度分別為1、2、4、6、8、10 g/L，菌劑接種量為5%，每個處理3個重復，進行石油降解實驗，轉速為150 r/min，溫度35 ℃，培養5、10、15 d后分別取樣，分別采用GC分析法進行殘余石油烴含量的分析及降解率的測定。

降解率=（m1-m2）/m1×100%，式中，m1為原油添加量，m2為原油殘余量。

2）原油性質對降解效果的影響。原油降解試驗中液體發酵培養基和原油樣品分開滅菌，原油濃度為4 g/L液體發酵培養基，混合菌劑接種量為5%，分為4個處理，每個處理3個重復，分別為處理1（新疆原油+混合菌劑）、處理2（大慶原油+混合菌劑），大慶原油和新疆原油的處理組分別作為對照，轉速為150 r/min，溫度35 ℃，培養15 d后，采用GC分析法進行殘余石油烴含量及降解率的測定。

1.2.5 復合菌劑對石油污水的處理試驗 石油污水取自某油田采油廠，復合菌劑由L-1和D-2菌株以1∶1的比例組成，將復合菌劑接種到1 000 mL的石油污水中，選擇溫度為35 ℃、轉速為150 r/min恒溫搖床培養，選擇復合菌劑的接種量、污水處理時間、石油污水的初始pH作為3個因素，選用L16（43）正交表，設計3因素4水平試驗，以石油污水的原油降解率為試驗指標，確定最佳水處理試驗條件。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選和分類鑒定結果

從新疆油田和大慶油田的原油樣品中分別分離得到7和6株原油降解菌，編號為L-1～L-7和D-1～D-6，其中有一株酵母菌，其余都是細菌，對每株菌進行原油降解試驗，發現L-1和D-2的降解效率最高。每株石油降解菌的降解效果如表3。

通過L-1和D-2菌株在LB培養基上交叉劃線，從平板中兩株菌交叉點的生長狀況來看，L-1和D-2菌株互相沒有拮抗作用，可以混合使用。

參照文獻[8]的步驟對L-1和D-2菌株作了初步鑒定：L-1和D-2菌株為革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢，L-1菌株在LB固體培養基上初期為黃色之后變為珊瑚紅色，菌落圓形，不透明，有光澤，D-2菌株在LB固體培養基上菌落白色、圓形、透明。

將菌株L-1和D-2的16S rDNA片段進行PCR擴增，得到大約1 500 bp的兩個片段，其擴增結果如圖1所示，將所得PCR產物提交公司測序，得到分別得到1 491 bp和1 482 bp的序列，將該序列和NCBI數據庫中的各近緣菌株的16S rDNA序列進行比對，應用Bioedit 7.0進行多重比較，分析其同源性，并構建系統發育樹（圖2），經分析，菌株L-1的序列和Sphingobacterium multivorum IAM 14316（Accession No.NR_040953）顯示了99%的同源性，菌株D-2的序列和Zoogloea oryzae A-7（Accession No. AB201043）顯示了97%的同源性，根據其系統進化特征，可確定菌株L-1為多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）和菌株D-2為動膠菌（Zoogloea oryzae）：

2.2 混合菌劑對原油的降解試驗結果

2.2.1 不同原油濃度對降解效果的影響 考慮到單個菌株對原油的降解率有限，而原油成分又較為復雜，本試驗采用混合菌劑對原油進行降解。將篩選出的高效石油烴降解菌L-1和D-2以1∶1的比例進行復配制成復合菌劑，以5%的接種量將其接入不同原油濃度的液體發酵培養基中，在不同處理時間下，其原油降解結果如圖3所示，圖3顯示，隨著原油濃度和處理時間的變化，混合菌劑對原油的降解率遵循不同的規律，當處理時間為5 d，混合菌劑對原油的降解率隨著原油濃度的增加逐漸降低，其范圍在12.4%～32.3%。當處理時間為10～15 d時，混合菌劑對原油的降解率在原油濃度低于4 g/L時，隨著原油濃度增加而逐步升高，當原油濃度高于4 g/L時，降解率隨著原油濃度的增加而逐步降低，當原油濃度為4 g/L時，混合菌劑對原油的降解率達到最大，這說明了原油濃度對原油的降解率有較大的影響，高濃度原油抑制了微生物的生長，而且原油濃度過大會造成降解體系中其他營養元素的相對缺乏，例如微生物生長所必須的氮、磷的相對缺乏，從而降低了微生物對原油的降解率。同時混合菌劑的作用時間對原油降解率也有影響，隨著混合菌劑處理時間的延長，原油的降解率相對增加。當混合菌劑的處理時間為5 d時，原油濃度為1 g/L的處理結果最佳；當混合菌劑的處理時間為10 d和15 d時，原油濃度為4 g/L的原油降解率最高。分析其原因可能是接種混合菌劑初期，由于其不適應新的生長環境，高濃度的含油量會抑制其生長繁殖，從而影響了原油的降解率.當處理時間大于10 d，即微生物適應了環境，進入了對數生長期，在一定范圍內（原油濃度小于4 g/L），其原油降解率就會隨原油濃度的增加而增加。

2.2.2 不同性質原油對降解效果的影響 相同條件下，微生物對稀油和重油的去除效果不同，其結果遵循對稀油的降解率大于對重油的降解率的規律[11]；即使是同一種原油，微生物對其不同組分也有著不同的降解率，對各組分的降解率從高到低依次為烷烴﹥芳香烴﹥膠質和瀝青，其中各個組分含量不同，會影響原油的生物可降解性[12]。混合菌劑對稀油和重油總烴及烷烴、芳香烴和膠質瀝青的去除結果如圖4所示，結果顯示對于總烴的降解率，微生物混合菌劑對稀油的作用效果大于重油，但是對于膠質瀝青的降解率，微生物復合菌劑對重油的作用效果大于稀油，分析其原因可能是由于油中膠質和瀝青的含量遠高于稀油。從圖4還可以看出，微生物復合菌劑對原油不同組分其降解率有所不同，這是由于微生物的代謝機制不同，故而對原油各組分的降解效果不同。因此，將微生物應用于石油污染治理中，不僅應該考慮多菌株的混合使用，還應該考慮菌株對芳香烴及膠質和瀝青綜合降解效果。

2.3 復合菌劑對石油污水處理效果的影響

復合菌劑對石油污水的處理采用L16（43）設計正交試驗[13]，試驗方案和試驗結果如表4所示，表4中R3﹥R1﹥R2，所以影響石油污水處理結果的試驗因素的主次順序為處理時間，初始pH，接種量。

從表4可以看出，初始pH 7.5、接種量12%、處理時間96 h為理論上最理想的處理方式，但是從節約資源、減少成本和縮短試驗周期方面考慮，最佳的試驗方案為pH 7.5、接種量9%、處理時間為72 h。

3 結論與討論

本試驗從原油樣品中分離篩選出2株高效石油降解菌，通過分析菌株的個體和群體形態、生理生化反應以及分子鑒定，最終確定這2株菌分別為多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）和菌膠團菌（Zoogloea oryzae）。考察L-1和D-2菌株石油降解能力，降解率分別達到46.5%和42.5%。所選菌株比其他研究篩選得到菌株[14，15]降解效率高、周期短。

所得兩株菌株以1∶1的比例進行復配制成復合菌劑，測定復合菌劑對不同處理時間、不同原油濃度和不同原油組分的原油降解率，結果顯示，處理時間、原油濃度和原油組分含量均會影響復合菌劑對原油的降解率，其中，當液體發酵培養基中原油濃度達到4 g/L時，原油的降解率最高；混合菌劑對稀油的降解效果要明顯優于重油。

復合菌劑應用于石油污水的處理，對其影響條件進行3因素4水平的正交試驗，結果顯示，當復合菌劑的接種量為9%時，石油污水的初始pH 7.5，處理時間為72 h，石油污水的處理效果最佳。

長期以來人們關注石油污染并進行了相關研究，已經取得了一定的成果[16]，但是石油降解菌的分離篩選都是從石油污染的土壤或者石油污水中。本試驗從原油中分離得到高效原油降解菌，將高效原油降解菌等比例復配組成復合菌劑應用于石油污水處理的初步試驗，取得了較好的結果，證明應用石油降解菌處理石油污水具有很大的應用潛力。本研究發現微生物對石油組分中芳香烴及膠質和瀝青的降解率較低，下一步應該著眼于芳香烴及膠質和瀝青的降解菌的篩選或培育。本研究所篩選的高效石油降解菌來源于油田的原油樣品，可以進一步嘗試應用于高濃度石油污染土壤的修復，為石油污染的土壤修復提供參考。

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