植物耐鹽基因篩選方法及其轉基因育種研究

韓強+++賀雪蓮+++卓仁英++何正權

摘要：植物對鹽脅迫的耐受性是一個復雜的過程，涉及滲透調節、離子平衡和區域化及抗氧化防御系統等多個方面。綜述了植物耐鹽基因的篩選方法（抗性表達文庫、耐鹽突變體的圖位克隆、基因差異表達和電子克?。┘巴ㄟ^這些方法所獲得的部分耐鹽基因；并在此基礎上簡述了耐鹽基因在改良植物抵御鹽脅迫方面的應用概況。

關鍵詞：鹽脅迫；耐鹽基因；基因克隆；轉基因育種

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3078-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.002

Screening Method of Salt Tolerance Genes and Transgenic Breeding in Plants

HAN Qiang1，2，HE Xue-lian1，2，ZHUO Ren-ying2，HE Zheng-quan1

（1. Biotechnology Research Center， China Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei， China；

2.Research Institute of Subtropical Forestry， The Chinese Academy of Forestry， Fuyang 311400， Zhejiang， China）

Abstract： Salt stress tolerance of plant is a complex process involving in osmotic adjustment， ion balance and regionalization and antioxidant defense system. The screening method for plant salt tolerance genes （resistance expression library construction， Map-based cloning of salt-tolerant mutant， differentially expressed genes and electronic cloning） and some salt tolerance genes obtained by these methods were reviewed， and based on this， the general situation of the application of salt-tolerant genes improving plants salt stress tolerance was briefly discussed.

Key words： salt stress； salt tolerance gene；gene cloning； transgenic breeding

高鹽環境嚴重影響植物的生長和發育，是造成作物減產的主要原因之一，高鹽環境甚至導致作物減產50%以上，嚴重制約了現代農業的發展。部分地區由于降雨量少、海水倒灌以及采用大棚種植，土壤中鹽分日積月累，導致世界范圍內土壤鹽漬化日趨嚴重和可耕地日趨減少。研究植物耐鹽脅迫的分子機制，尋找改良植物耐鹽性的有效方法已成為植物分子生物學家研究的熱點。植物耐鹽機理涉及多種基因和分子的協調作用[1]，一般來講，植物的耐鹽性與鹽分的吸收、運輸、分配、生物膜功能、離子區域化作用及滲透調節物質的合成和積累密切相關[2]。對于植物耐鹽基因工程來講，獲得關鍵耐鹽基因及其功能鑒定顯得尤為重要。本文綜述了近幾年來耐鹽基因的主要篩選方法（抗性表達文庫、抗性突變體的圖位克隆、基因差異表達、基因電子克隆）和耐鹽相關基因及其在植物改良方面的應用。

1 耐鹽基因篩選表達文庫

通過轉基因技術提高植物耐鹽性的基礎是了解植物耐鹽的分子機制和耐鹽相關的基因，而解決這兩個問題首先是要克隆到足夠多的耐鹽相關基因。目前，主要是通過構建cDNA文庫和基因組文庫篩選法大規模篩選耐鹽相關基因。

1.1 cDNA-文庫

cDNA是由信使RNA反轉錄而來的，它代表特定的組織材料在特定階段所表達的基因，排除了基因組文庫中內含子序列對篩選相關性狀基因的影響，使篩選相關基因更加簡單。例如cDNA-酵母表達文庫，作為生產真核異源蛋白的宿主菌，酵母集分子遺傳操作、原核微生物的生長性質、真核蛋白質的翻譯后加工修飾等特點于一體，并且繁殖快，操作簡單，是一種研究遺傳學和分子生物學的有效工具，在挖掘耐鹽資源的研究中得到廣泛應用。楊曄[3]以篩選出的高耐鹽旱柳無性系I-32為材料構建了旱柳全長cDNA文庫。對隨機挑取的陽性克隆進行聚合酶鏈式反應（PCR）鑒定，插入片段平均長度為1 000 bp左右， 說明所構建的文庫達到了用于目的基因分離篩選和表達的建庫要求。通過尿嘧啶缺陷型培養基添加80～130 g/L氯化鈉篩選文庫，得到兩個耐受130 g/L 的酵母轉化子，插入片段分別為615 bp和1 152 bp，序列比對結果表明1 152 bp的cDNA與耐鹽性有關。

1.2 基因組-文庫

構建插入大片段基因組文庫則可以更容易地分離到目的基因的全長DNA序列及調控元件?；蚪M文庫主要是將大的基因組DNA片段與YAC或BAC連接轉化酵母、細菌進行篩選。孟祥宗[4]以pCClBAC為載體，構建了鹽藻（Dunaliella viridis）基因組細菌人工染色體（BAC）文庫。該文庫共有9 216個轉化子，插入片段平均長度為55 kb，約覆蓋4倍鹽藻基因組。同時還構建了該文庫的四維PCR基因篩選體系，利用該體系可以通過4輪PCR快速篩選獲得陽性單克隆，為克隆鹽藻耐鹽基因提供了更加便利的條件。Wang等[5]則構建了鹽芥的細菌人工染色體文庫（BIBAC），通過農桿菌侵染擬南芥篩選耐鹽基因，對200個株系進行篩選，發現其中1個株系與野生型相比具有更高的耐鹽性，說明該文庫可能含有耐鹽基因。endprint

2 植物耐鹽性突變體的誘導篩選與耐鹽基因圖位克隆

圖位克隆是在植物分子標記圖譜的基礎之上建立的一種基因克隆技術。首先，利用分子標記技術對目的基因進行定位；其次，用與目的基因緊密連鎖的分子標記篩查DNA文庫，然后構建包含目的基因區域的物理圖譜；最后，通過染色體步移等方法找到包含目的基因的克隆。隨著分子標記圖譜的發展，圖位克隆技術已逐漸成為一種分離基因的常規方法，并被廣泛應用。篩選植物耐鹽性突變體并對其所在基因進行圖位克隆是獲得相關耐鹽基因的重要手段。突變體的獲得方法主要有化學誘變、物理誘變和T-DNA插入法等。周立名等[6]用EMS（甲基磺酸乙酯）誘變處理海沃德與紅陽獼猴桃葉片，在含1.0 g/L NaCl的培養基上通過胚性愈傷組織誘導得到11株海沃德和10株紅陽的組培苗，再通過繼代培養篩選鑒定，誘變處理所得植株與正常培養的植株相比，其耐鹽性明顯提高。毛桂蓮等[7]用不同劑量的60CO γ射線對以枸杞葉為外植體誘導出的愈傷組織進行輻射處理，并將恢復增殖的愈傷組織采用逐步提高鹽濃度的方法，直到篩選出耐1%的愈傷組織變異體，通過對其生理生化的分析表明，變異體在不同鹽濃度脅迫下干、鮮重增長均高于對照組。高蕾[8]通過T-DNA插入法轉化擬南芥獲得了突變體AT6和AT13，其在萌芽和幼苗生長過程中表現了耐鹽性狀，并通過對Tail-PCR擴增產物的測序結果和擬南芥基因組序列的比對進而確定了AT6和AT13突變體中T-DNA的插入位點分別位于基因At1g73660的第三個外顯子上和At3g58110（含有一個內含子的功能未知蛋白）的第 854個堿基處，因此造成基因的功能缺失。Ren等[9]分離了鹽脅迫下水稻耐鹽品種的一個數量性狀位點，并利用圖位克隆技術克隆得到基因SKC1，該基因的優先表達部位是木質部導管周圍的薄壁細胞，該基因還是編碼HKT型轉運成員中的一個。Voltage-clamp分析表明SKC1蛋白的功能是作為Na+的選擇性運輸者，生理學分析表明，SKC1基因與調節鹽脅迫下K+/Na+的動態平衡有關。

3 基因差異表達分析

以差異篩選、削減雜交等基本方法為出發點，研究基因表達差異的方法在被不斷完善。目前，常用的基因差異表達分析的技術主要有DDRT-PCR、RDA、SSH、cDNA-AFLP、cDNA微陣列技術（cDNA microarrays）等。

3.1 mRNA差異顯示技術

mRNA差異顯示反轉錄PCR（Differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）技術是由Liang和Pardee1992年創立的，自創立以來，該技術已經成功分離出水稻抗鹽堿，小麥春化、水稻抗稻瘟病等多種基因。聶新輝等[10]分別提取脅迫和非脅迫棉花葉片的總RNA，采用mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR），經二次PCR擴增，獲得了41條表達穩定且重復性較好的差異條帶。周涵韜等[11]利用從福建龍海紅樹林自然保護區采集白骨壤的隱胎生果實為材料，利用mRNA差異顯示技術分離鹽脅迫下紅樹植物白骨壤耐鹽相關cDNA，發現了3個差異DNA片段只在高鹽培養條件的白骨壤基因組中表達，而在無鹽培養條件中沒有出現。對這3個差異cDNA片段進行RNA雜交，結果顯示，只有一個片段在高鹽中有雜交斑點，并且在無鹽中沒有雜交斑點，而其余2個片段在高鹽和無鹽條件下都沒有雜交斑點出現。進而表明在高鹽中有雜交斑點的片段就是耐鹽相關cDNA。

3.2 代表性差異分析

代表性差異分析（Representational difference analysis，RDA）與SSH相比在富集能力上非常出色，對靶序列的富集程度可超過106倍[11]，即使在占試驗材料很小比例（少于1%）的細胞中差異表達的基因也可以輕易獲得分離[12]。然而，由于沒有解決不同的mRNA在豐度上存在巨大差異的問題，經過多輪扣除雜交之后，RDA會優先富集高拷貝序列而不利于低拷貝序列的富集。劉小磊[13]將三葉期鹽稻1號秧苗分為兩組，處理組在300 mmol/L（1.76%） NaCl溶液處理24 h，對照組不加NaCl。利用cDNA代表性差異分析（RDA）技術，分離到1種cDNA差異片段（基因）與鹽脅迫相關，得到的cDNA差異片段的蛋白翻譯序列和推測的水稻脅迫誘導蛋白的氨基酸序列具有同源性。

3.3 抑制消減雜交

抑制消減雜交（Suppressive subtraction hybridization，SSH）是20世紀末期發展起來的一種高效分離差異表達基因的方法。該技術因具有操作簡便、特異性強、背景低、重復性好的優點，在基因克隆方面應用較多。劉天明等[14]利用抑制消減雜交技術構建了條銹菌接種初期小麥抗性種質葉片的SSH-cDNA文庫。通過對文庫的篩選，獲得了一些與植物抗逆信號轉導、轉錄調控及防御有關的基因，如O-甲基轉移酶基因ZRP4，但沒有對其功能進行進一步的研究。Mohammad等[15]用3%鹽溶液處理紅樹，構建了紅樹根的cDNA文庫，用SSH篩選與鹽脅迫相關基因，從SSH文庫中分離并測序了240個上調的EST（表達序列標簽），有13個基因與該植物的耐鹽性有關，其中確定參與類異戊二烯的合成的兩個轉錄因子和幾個基因與紅樹的耐鹽性有關。

3.4 cDNA 擴增片段長度多態性

cDNA擴增片段長度多態性（cDNA-amplified fragmentlength polymorphism，AFLP）技術是Bachem等[16]提出的一種基因差異表達鑒定技術，因具有可靠性、高效性和不需預先知道序列信息等優點而被廣泛應用于植物基因的克隆[17-19]，賈晉等[20]采用256對引物對不同鹽濃度梯度處理48 h后的6個鹽爪爪樣品進行cDNA-AFLP分析，共得到差異表達條帶155個，片段大小分布為100～1 000 bp，測序后獲得176個新表達序列標簽（ESTs）。endprint

3.5 cDNA微陣列

cDNA微陣列（cDNA microarrays）技術可以定量檢測基因表達水平，既可以同時比較不同樣品基因表達水平的差異，也能夠提供某一基因或一群基因的表達模式與其他基因表達模式相互間關聯的信息。在轉錄組水平比較分析相近物種的基因表達譜（Expressed profile）是一種揭示耐鹽性植物與非耐鹽性植物表型差異的有效方法[21]。趙寶存等[22]利用基因芯片技術，分析鹽脅迫下耐鹽小麥RH8706-49的小麥根部基因的表達情況，獲得了61 215個小麥基因的差異表達圖譜，其中有近20%的基因表達量發生了變化（上調和下調），這些基因可能與耐鹽密切相關。趙潔[23]利用Affymetrix公司的截型苜蓿基因組芯片（Medicago genome array），包括61 278個探針，檢測疏葉駱駝刺幼根在220 mmol/L NaCl脅迫處理0 h和24 h的差異表達基因，差異表達基因266個，其中上調的有147個，下調的有119個，分析發現差異表達基因中有些對疏葉駱駝刺的耐鹽性可能有重要的影響，其中富含脯氨酸蛋白基因（PRP2，Mtr.40069.1.S1_x_at）是PRPs家族成員，被假設為植物生長調控、導管分化、抗逆的分子構架[24]。Kawasai等[25]利用基因芯片對水稻耐鹽品種（Pokkali）在鹽處理后不同時間的基因表達譜進行了比較，結果表明，在鹽處理15 min至6 h內，約有33%的基因出現上調表達，而在對照品種中只有7%的基因上調表達。Michael等[26]運用高通量微矩陣從18 432個點陣中尋找擬南芥的耐鹽基因。

4 基因電子克隆

基于表達序列標簽（Expressed sequence tags，ESTs）的基因電子克隆（Gene cloning）策略是近年來發展起來的一門快速克隆基因的新技術，其技術核心是利用生物信息學組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長cDNA序列進一步利用RT-PCR的方法進行克隆分析驗證。葉妙水[27]根據陸地棉耐鹽性抑制消減文庫中的一個S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的同源EST設計引物，利用RACE結合RT-PCR技術克隆陸地棉S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA全長，命名為GhSAMS。Real-time PCR分析結果表明，GhSAMS的表達受鹽脅迫誘導，在鹽敏感材料中誘導被推遲，而且該基因在耐鹽材料“9835”中的表達水平明顯高于鹽敏感材料S9612。黃驥等[28]從鹽脅迫下水稻幼苗的cDNA文庫中分離得到約500 bp的EST序列S121，利用S121序列作為信息探針，搜索GenBank中的水稻EST庫，將兩個與S121部分序列一致的EST重疊群進行拼接后設計引物克隆出OsZFP基因，該基因可能涉及鹽脅迫下基因的表達調控。

5 與耐鹽相關的基因

目前已經克隆了許多耐鹽堿的相關基因（表1）。由表1可知，根據其作用機制可分為以下5類基因：①具有滲透保護功能的基因；②與離子吸收和區域化有關的基因；③與抗氧化脅迫相關的基因；④參與脅迫信號轉導的基因；⑤編碼轉錄因子的基因。

6 植物耐鹽性改良

作為世界上人口最大的國家，糧食對于每一個中國人而言尤為重要，而土壤鹽漬化是影響植物正常生長，導致農作物減產的主要因素之一。據統計，全球有3.8億hm2的鹽堿土地，而中國1億hm2耕地中有10%屬于鹽堿土地，嚴重影響了中國農業的發展。因此，研究植物的耐鹽機理，改善植物在鹽漬化土壤條件下的生長具有重大意義。

改善植物在鹽漬化土壤中的生長狀況主要有兩種方法：一是通過大型的排灌工程或施用大量化學藥劑來改良土壤；二是通過生物技術培育耐鹽植物品種來適應鹽漬環境。前者不僅耗資巨大，且大量化學物質的施入還會加重土壤的次生鹽漬化；而隨著基因工程的飛速發展，已經成功克隆了一些耐鹽相關基因，并獲得了耐鹽性顯著提高的轉基因植物。目前已報道的轉基因耐鹽植物有水稻[27]、豆瓣菜[28]、番茄[29]、煙草[30]、楊樹[31]等。Jang等[29]將編碼大腸桿菌海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）融合蛋白的雙功能蛋白（TPSP）基因轉入水稻，轉基因水稻中海藻糖的積累顯著增加，并表現出對干旱、鹽漬、寒冷等多種環境脅迫的抗性。李銀心[30]將山菠菜甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因經根癌農桿菌介導轉入豆瓣菜，得到經PCR和Southern檢測呈陽性的再生植株。張桂和等[31]將海蓬子Na+/H+逆向轉運蛋白基因轉人番茄中，轉基因植株的相對含水量、質膜透性、K+/Na+比和葉綠素含量明顯高于對照，這說明Nhap基因起到了調節作用。Qiu等[32]將異戊烯轉移酶基因通過擬南芥侵染成功地轉入煙草，在用150 mmol/L NaCl脅迫時，轉基因植株葉綠素含量和SOD的活性均高于對照，而MDA的水平卻低于對照，說明異戊烯轉移酶基因有助于植物耐鹽性的提高。楊春霞[33]將DREB1C基因轉入楊樹，將4周齡的對照植株和轉基因植株分別放入1/2 MS液體培養基（濃度為150 mmol/L NaCl和 200 mmol/L NaCl）中，觀察植株在兩種鹽梯度下的萎蔫情況及其差異。4周后發現轉基因植株的耐鹽能力均強于對照植株。

7 小結與展望

植物的耐鹽性是多基因控制的，涉及離子吸收、轉運、脅迫響應和解毒等諸多生理過程，上述對這些生物過程相關基因的鑒定方法都各有優劣。耐鹽篩選表達文庫是一種實用性較高的基因篩選方法，一個好的文庫可以同時篩選到多種耐鹽基因，在篩選新的耐鹽基因時可大大節約時間，但利用表達文庫篩選耐鹽基因是一項繁重的工作，而且其揭示的基因信息不夠完整，部分基因功能往往需要進一步鑒定。在不清楚基因產物和結構的情況下，可以利用圖位克隆實現基因克隆，但圖位克隆法仍需構建完整的基因組文庫，建立飽和的分子標記連鎖圖，并且涉及大量的測序工作，不適于基因組大、標記數目不多和重復序列較多的植物。與傳統的基因克隆方法相比，電子克隆具有速度快、對試驗儀器需求簡單、試驗成本和技術要求較低等優點。但也存在一些缺點，電子克隆受到已有EST數目的限制，其應用的普遍性較低。因此，電子克隆和圖位克隆一樣，更適合在擬南芥、水稻、番茄等模式植物中使用。利用基因差異表達分析方法克隆耐鹽基因也存在一些需要解決的問題，例如得到的通常都是較小的差異片段，要獲得全長cDNA，仍需進行cDNA文庫篩選；對mRNA質量要求較高，對于某些材料不適用；一些低拷貝差異表達基因的信息易丟失等。endprint

隨著植物耐鹽機理研究的深入，耐鹽基因篩選技術的不斷發展和改進，將不斷獲得更多的與植物抵御鹽脅迫相關的基因和轉基因耐鹽植物。相信隨著分子生物學理論和試驗技術的快速發展，人們有望更好地揭示植物的耐鹽機理，這將為植物耐鹽性的遺傳改良提供可能。

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收稿日期：2014-11-15

基金項目：國家自然科學基金項目（31300508）

作者簡介：韓 強（1988-），男，湖北大悟人，在讀碩士研究生，研究方向為植物抗逆性，（電話）18258114260（電子信箱）John_h9@163.com；

通信作者，何正權，教授，（電子信箱）zhq_he@ctgu.edu.cn。endprint