陳皮石油醚相中抗蘋果腐爛病菌活性物質研究

張相飛 杜春華 郝雙紅 李凌緒

摘要：陳皮石油醚提取物中富含對蘋果腐爛病菌（Valsa mali）具有抑菌活性的物質，研究通過反復硅膠柱層析、制備高效液相色譜、重結晶對餾分F15純化獲得了3個活性單體A、B、C。核磁共振數據顯示A、B、C分別為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素和川陳皮素。采用生長速率法測定A、B、C的抑菌活性，結果表明，3個化合物對蘋果腐爛病菌的EC50分別為68.19、1.56、24.02 μg/mL，其中橘皮素對蘋果腐爛病菌的抑菌活性最強。

關鍵詞：陳皮；蘋果腐爛病菌（Valsa mali）；多甲氧基黃酮；分離純化；抑菌活性

中圖分類號：S432.9+8；S482.2+92 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3150-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.020

Research of Active Material in Petroleum Ether Extraction from Tangerine Peel

for in Vitro Control of Valsa mali

ZHANG Xiang-feia，DU Chun-huaa，HAO Shuang-honga，LI Ling-xub

（a.College of Chemistry and Pharmaceutical Science； b.College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University，

Qingdao 266109， Shandong，China）

Abstract： Petroleum ether extraction from tangerine peel was rich in active ingredients against Valsa mali. Research through purification obtained three active monomers A，B，C by repeated silica gel column chromatography，the preparation of high performance liquid chromatography and recrystallization on fraction F15. Monomeric compounds A，B and C were determined as 3，5，6，7，8，3′，4′-heptamethoxyflavone， tangeretin and nobiletin，respectively. Growth rate method was used to determine the bacteriostatic activity of A，B，C. The results showed that all the three monomeric compounds were strong inhibitors against Valsa mali and the EC50 were 68.19，1.56 and 24.02 μg/mL respctively. Among them tangeretin had strongest antifungal activity against Valsa mali.

Key words： tangerine peel； Valsa mali； polymethoxyflavones； separation； antifungal activity

蘋果樹腐爛病是一種由蘋果腐爛病菌（Valsa mali）引起的毀滅性的病害，主要為害主枝主干，在中國蘋果主產區的總體發生率為52.7%，造成巨額損失[1]。化學防治是目前生產上防治蘋果樹腐爛病的主要手段，但現有的化學農藥很難有效控制蘋果樹腐爛病的發生與危害，亟需開發新型的農藥。天然產物因其活性高、結構新穎被視為新型農藥先導化合物的重要來源。陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，含有揮發油、黃酮、生物堿、肌醇等活性成分，具有理氣健脾、燥濕化痰的功能[2，3]。同時陳皮中也富含具有抑制霉菌作用的活性物質[4-7]，本課題組的前期研究表明陳皮脂溶性成分具有強烈的抑制蘋果腐爛病菌生長的活性[8，9]。本研究擬在活性追蹤的指導下對陳皮提取物的石油醚相進行分離純化，明確其中對蘋果腐爛病菌具有抑菌活性的化學成分，為開發防治蘋果樹腐爛病的新型農藥提供先導化合物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

陳皮于2011年7月購自青島市城陽區富康大藥房，產地為浙江黃巖。陳皮在室內陰干，磨粉備用。

1.2 供試菌種

供試植物病原菌為蘋果腐爛病菌，由青島農業大學化學與藥學院提供。

1.3 儀器設備

核磁共振儀為Bruker AV-500型。高效液相色譜儀為天津科器高新技術公司YZS-3型（ODS C18柱，40 mm×300 mm，10～30 μm）。柱色譜用100～200目硅膠及薄層色譜硅膠H均購自青島海洋化工公司。

1.4 化合物的提取、分離與純化

取陳皮粉末3 kg加入9 L的75%乙醇60 ℃提取3 h，過濾收集濾液。重復提取3次后合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得陳皮粗提物126.37 g。粗提物經石油醚萃取，得石油醚相24.85 g。取石油醚相20 g經硅膠柱層析分離，以石油醚∶乙酸乙酯梯度（100∶0→100∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶100）洗脫，經TLC（薄層色譜法）分析后合并相同組分，共獲得15個餾分，編號為F01-F15。F15經反復硅膠柱層析分離，用石油醚∶乙酸乙酯（3∶1）洗脫獲得F1501、F1502、F1503共3個組分。F1502經中壓制備HPLC（高效液相色譜法）分離，流動相為乙腈，UV（紫外光）檢測器，波長255 nm，流速15 mL/min，獲得化合物A（保留時間26 min）32 mg和化合物B（保留時間21 min）21 mg。F1503經丙酮重結晶獲得化合物C共81 mg。

1.5 抑菌活性測定方法

采用生長速率法測定15個餾分及單體化合物的抑菌活性，試驗過程中所用培養基、玻璃制品等均經滅菌。稱取適量餾分或單體化合物，用少量丙酮溶解，加入到已融化的60 ℃左右的PDA培養基中，搖勻，倒入直徑60 mm的培養皿中，培養基冷卻凝固后移入生長一致、直徑為4 mm的蘋果腐爛病菌菌餅。以加入等量丙酮的培養基為對照，每處理重復3次。將培養皿置于27 ℃恒溫培養，至對照接近長滿菌時采用十字交叉法測量菌落直徑，抑菌率計算公式為：

抑菌率=（對照組菌落純生長量—處理組菌落純生長量）/對照組菌落純生長量×100%

使用SPSS20.0的Probit模型進行數據處理，得出不同化合物的EC50和毒力方程。

2 結果與分析

2.1 不同餾分對蘋果腐爛病菌的抑菌活性

陳皮乙醇提取物的石油醚萃取相經硅膠柱層析后共獲得了15個餾分，采用生長速率法測定了不同餾分對蘋果腐爛病菌的抑菌作用，濃度為200 mg/mL時各餾分的抑菌作用如表1所示。由表1可知，石油醚相中的活性成分主要存在于高極性部分，其中餾分F15對蘋果腐爛病菌的抑菌率最高，為（96.73±1.36）%，抑菌活性最強，因此優先對餾分F15進行了分離純化。

2.2 化合物結構表征

化合物A為無色至黃綠色針狀結晶（乙腈），熔點129～130 ℃。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.816（1H，s，H-2′），7.016（1H，s，J=8.5 Hz，H-5′），7.845（1H，d，J=8.5 Hz，H-6′），4.104（3H，s，OCH3），4.010（3H，s，OCH3），3.979（9H，s，3×OCH3），3.954（3H，s，OCH3），3.894（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：152.985（C-2），140.619（C-3），173.738（C-4），148.069（C-5），143.713（C-6），151.166（C-7），137.692（C-8），146.635（C-9），114.955（C-10），123.307（C-1′），110.839（C-2′，C-5′），150.910（C-3′），148.617（C-4′），121.792（C-6′），62.176、61.837、61.743、61.562、59.728（3-、5-、6-、7-、8-C），55.865、55.777（3′、4-C′）。其核磁共振氫譜、碳譜數據與3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮一致[10，11]。故推斷化合物A為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮，分子式為C22H24O9，分子量為432。

化合物B為無色針狀結晶（乙腈），熔點50～51 ℃。1H-NMR（CDCl3，500 MHz） δ：6.613（1H，s，H-3），7.884（2H，d，J=7.2Hz，H-2′，H-6′），7.033（2H，d，J=6.8Hz，H-3′，H-5′），4.108（3H，s，OCH3），4.026（3H，s，OCH3），3.955（6H，s，2×OCH3），3.896（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：162.333（C-2），106.776（C-3），177.301（C-4），144.127（C-5），138.145（C-6），151.386（C-7），148.445（C-8），147.758（C-9），114.973（C-10），123.956（C-1′），127.734（C-2′，C-6′），114.556（C-3′，C-5′），161.183（C-4′），62.258、62.021、61.820、61.647（5-、6-、7-、8-C），55.510（4′-C）。其1H-NMR、13C-NMR數據與文獻一致[12，13]，故鑒定為5，6，7，8，4′-五甲氧基黃酮（橘皮素，紅橘素，Tangeretin），分子式為C20H20O7，分子量為372。

化合物C為無色至黃綠色針狀結晶（丙酮），熔點134～135 ℃。1H-NMR（CDCl3，500MHz） δ：6.628（1H，s，H-3），7.414（1H，s，H-2′），6.999（1H，d，J=8.2Hz，H-5′），7.575（1H，d，J=8.5Hz，H-6′），4.110（3H，OCH3），4.030（3H，OCH3），3.984（3H，OCH3），3.971（3H，OCH3），3.958（3H，2×OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125MHz）

δ：160.896（C-2），106.776（C-3），177.226（C-4），143.961（C-5），137.886（C-6），151.298（C-7），147.597（C-8），148.309（C-9），114.744（C-10），123.890（C-1′），108.387（C-2′），149.152（C-3′），151.783（C-4′），111.079（C-5′），

119.491（C-6′），62.152、61.855、61.726、61.572（5-、6-、7-、8-C），55.973、55.851（3′-、4′-C）。其核磁共振碳譜、氫譜數據與5，6，7，8，3′，4′-六甲氧基黃酮（川陳皮素，Nobiletin）一致[10，14]。

2.3 單體化合物活性測定

為了明確石油醚相中的抑菌活性成分，采用反復硅膠柱層析、重結晶、制備HPLC等方法對餾分F15進行了進一步的分離純化，獲得了3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等3個活性單體。活性測定結果表明3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素對蘋果腐爛病菌的EC50分別為68.19、1.56、24.02 μg/mL（表2），橘皮素可能是石油醚相中對蘋果腐爛病菌產生抑菌活性的主要成分。

3 小結與討論

陳皮是我國傳統中藥，其來源為蕓香科柑橘屬植物柑橘的果皮，富含黃酮等活性成分。多甲氧基黃酮（Polymethoxyflavones，PMFs）主要存在于蕓香科植物中，相比黃酮苷，其分子空間構型更具平面性，極性更小，更容易穿透細胞膜進入細胞，影響細胞的生長活動。PMFs因其良好的抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等活性受到國內外學者的廣泛關注[15-17]。同時PMFs也是柑橘果實貯存期重要的抗病物質，在果實采摘后可抵抗柑橘青霉菌（Penicillium digitatum）[15，18]、柑橘褐腐疫霉病菌（Phytophthora citrophthora）[19，20]等病菌的侵染，且其抗侵染能力與其含量呈正相關[21]。但PMFs對其他植物的病原菌是否有抑菌活性少有報道，Almada-Ruiz等[22]曾從柑橘的冷榨油中分離得到了4個多甲氧基黃酮類化合物，體外活性試驗證實3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等對膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）都有較好的活性，其中橘皮素和川陳皮素在100 μg/mL時均可完全抑制膠孢炭疽菌的生長。本研究從陳皮乙醇提取物的石油醚相中分離得到了3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等3個多甲氧基黃酮類化合物，活性測定發現其對蘋果腐爛病菌均有很強的抑菌活性，EC50分別為68.19、1.56和24.02 μg/mL。朱蔚等[23]從柑橘皮乙醇提取物中獲得了5個多甲氧基黃酮類化合物，并評價了其抑菌活性，在濃度為1 000 μg/mL時川陳皮素和橘皮素對茶樹云紋葉枯病菌并沒有明顯的抑制生長活性（抑菌圈直徑小于10 mm），這可能與川陳皮素及橘皮素的抑菌譜有關。

由蘋果腐爛病菌侵染引起的蘋果樹腐爛病在中國分布廣、危害重，是北方蘋果產區的第一大病害。蘋果樹腐爛病防治困難，目前的藥劑難以取得理想的效果。橘皮素等多甲氧基黃酮類化合物對蘋果腐爛病菌有較好的抑菌活性，可作為開發高效新型藥物的先導化合物。

參考文獻：

[1] 雍道敬，李保華，王彩霞.蘋果樹腐爛病菌不同致病力菌株對蘋果的誘導效應[J].植物生理學報，2014，50（6）：810-816.

[2] 趙小艷，呂武清.陳皮的研究概況[J].中國藥業，2006，15（15）：68-70.

[3] 歐立娟，劉啟德.陳皮藥理作用研究進展[J].中國藥房，2006， 17（10）：787-789.

[4] 雷 鋼，王永強，張雅軍，等.柑橘皮浸膏的防霉、飼養效果研究[J].武漢工業學院學報，2001（4）：51-54.

[5] 趙寶玉，李紹君，王軍亮，等.桔皮提取物抑制霉菌試驗[J].動物醫學進展，1998，19（2）：30-33.

[6] 馬慶一，陳春濤，荊曉艷，等.橙皮苷等橘皮活性成分的提取和抑菌作用研究[J].食品科學，2004，25（12）：112-115.

[7] 嚴贊開，胡春菊.橙皮甙的抑菌效果研究[J].西北農業學報，2004，13（2）：87-89.

[8] 李凌緒，魏 艷，杜春華，等.橘皮提取物對7種農業植物病原真菌的抑菌活性研究[J].安徽農業科學，2008，36（30）：13242-13243.

[9] 李凌緒，曲亮亮，孟昭禮.橘皮色素的抑菌活性[J].湖北農業科學，2010，49（1）：80-82.

[10] HAMDAN D，EL-READI M Z，TAHANI A，et al. Chemical composition and biological activity of Citrus jambhiri Lush[J].Food Chemistry，2011，127（2）：394-403.

[11] 錢士輝，陳 廉.陳皮中黃酮類成分的研究[J].中藥材，1998，21（6）：301-302.

[12] 楊武亮，陳海芳，余金寶，等.枳殼化學成分研究[J].中藥材，2008，31（12）：1812-1815.

[13] CHEN J，Antonio M. M， Wilbur W. Tow new polymethoxylated flavones，a class of compounds with potential anticancer activity，isolated from cold pressed dancy tangerine peel oil solids[J]. Journal of Agriculture and Chemistry，1997，45：364-368.

[14] 趙雪梅，葉興乾，席嶼芳，等.胡柚皮中的黃酮類化合物[J].中草藥，2003，34（1）：11-13.

[15] ORTU？譙O A，B？魣IDEZ A，G？魷MEZ P，et al. Citrus paradisi and Citrus sinensis flavonoids：Their influence in the defence mechanism against Penicillium digitatum[J]. Food Chemistry，2006，98（2）：351-358.

[16] 車 震，康 娜，郝東寧，等.多甲氧基黃酮對人膠質母細胞瘤細胞系生物學特性的影響[J].現代生物醫學進展，2013，13（33）：6471-6474.

[17] 王 磊，蘇學素，付陳梅，等.柑橘中多甲氧基黃酮生物活性及應用研究進展[J].食品科學，2009，30（7）：285-290.

[18] ARCAS M C，BOT？魱A J M，ORTU？譙O A M，et al. UV irradiation alters the levels of flavonoids involved in the defence mechanism of Citrus aurantium fruits against Penicillium digitatum[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106（7）：617-622.

[19] DEL R？魱O J A，G？魷MEZ P，BAIDEZ A G，et al. Changes in the levels of polymethoxyflavones and flavanones as part of the defense mechanism of Citrus sinensis（cv.Valencia Late）fruits against Phytophthora citrophthora[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（7）：1913-1917.

[20] DEL R？魱O J A，ARCAS M C， BENAVENTE-GARC？魱A O，et al. Citrus polymethoxylated flavones can confer resistance against Phytophthora citrophthora，Penicillium digitatum， and Geotrichum species[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（10）：4423-4428.

[21] ORTU？譙O A，ARCAS M C，BOT？魱A J M，et al. Increasing resistance against Phytophthora citrophthora in tangelo Nova fruits by modulating polymethoxyflavones levels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（10）：2836-2839.

[22] ALMADA-RUIZ E，MART？魱NEZ-T？魪LLEZ M ？魣，HERN？魣NDEZ-？魣LAMOS M M，et al. Fungicidal potential of methoxylated flavones from citrus for in vitro control of Colletotrichum gloeosporioides，causal agent of anthracnose disease in tropical fruits[J].Pest Management Science，2003，59（11）：1245-1249.

[23] 朱 蔚，高旭輝，秦金花，等.柑橘皮乙醇提取物中抑菌成分的分離與鑒定[J].植物保護，2013，39（4）：61-64.

收稿日期：2014-11-15

基金項目：山東省自然科學基金項目（ZR2010CQ026）

作者簡介：張相飛（1981-），男，山東萊陽人，實驗師，碩士，主要從事農藥學研究，（電話）15953259290（電子信箱）88121029@qq.com；

通信作者，李凌緒，（電話）13455276690（電子信箱）lingxulipvi@126.com。