臍帶間充質干細胞對衰老樹鼩模型代謝的影響

陶劍，潘興華，王金祥，楊建勇

臍帶間充質干細胞對衰老樹鼩模型代謝的影響

陶劍，潘興華，王金祥，楊建勇

目的通過D-半乳糖連續注射誘導樹鼩代謝紊亂建立衰老模型，評價臍帶間充質干細胞輸注對衰老樹鼩代謝的影響。方法12只雌性樹鼩分為空白組（2只）和模型組（10只），模型組每天頸背部皮下注射10%的D-半乳糖2.5ml/(100 g·d)，空白組皮下注射等體積注射用水，連續8 w后，檢測兩組外周血中超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH-PX)和丙二醛(MDA)的含量變化；建立衰老樹鼩模型后，經尾靜脈輸注雄性樹鼩臍帶間充質干細胞2次，2 w后對樹鼩外周血中SOD、GSH-PX和MDA的含量進行測定。結果連續注射D-半乳糖8 w后，模型組樹鼩體重下降，血漿SOD和GSH-PX的活性降低，MDA含量明顯升高(P＜0.05)。輸注樹鼩臍帶間充質干細胞后，血清SOD和GSH-PX活性升高，MDA含量明顯降低(P＜0.05)。結論連續注射D-半乳糖可誘導樹鼩出現衰老的特征性代謝改變，輸注樹鼩臍帶間充質干細胞對衰老樹鼩的代謝具有改善作用。

D-半乳糖；衰老；樹鼩；臍帶；間充質干細胞

衰老與機體的代謝障礙有密切關系，由D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導加速的嚙齒類衰老模型動物，建立方法是給動物連續注射大劑量D-gal，其進入細胞后不能被徹底代謝，引起細胞代謝紊亂，產生過量的超氧陰離子自由基損害細胞，可引起機體的衰老，這種D-gal超負荷造成的衰老模型，其各種生理、生化指標變化均與自然衰老類似[1]。

樹鼩是小型哺乳類動物，其與靈長類動物有較近的親緣關系[2]。我們利用樹鼩作為實驗動物，進行抗衰老新型動物模型的研究。通過觀察樹鼩連續注射D-gal后，其血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛(MDA)等氧化應激指標的變化，評價樹鼩作為衰老動物模型的可行性；并觀察樹鼩臍帶間充質干細胞(MSC)輸注干預后，樹鼩上述代謝指標的變化，評價補充MSC對衰老動物代謝的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料細胞培養液DF12購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司，D-gal購自Sigma公司，SOD測試盒、GSH-PX測試盒和MDA測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2衰老模型的建立雌性樹鼩購自昆明醫科大學實驗動物中心，健康，1.5歲齡，體重(150±20)g；隨機分為對照組和模型組：模型組10只，每天頸背部皮下注射10%的D-gal 2.5ml/(100 g·d)，連續8 w[2]，建立衰老樹鼩模型?？瞻捉M2只，皮下注射等體積注射用水。

1.3 MSC的分離和培養[3-4]懷孕25~30 d的樹鼩購自中國科學院昆明動物所實驗動物中心。脫頸處死，無菌條件下分離樹鼩臍帶，剪碎、收集細胞懸液，離心，用干細胞培養液重懸細胞，調節細胞密度，將6×104個有核細胞接種到T 25 cm的塑料培養瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養，原代細胞接種24 h后，除去未貼壁的細胞，用D-Hank液換洗，換液；當形成一些較大的細胞克隆時，用D-Hank液將培養的細胞洗2遍，加入0.25%胰酶(含0.01%EDTA)消化液，室溫消化2 min，用牛血清終止胰蛋白酶的作用，取部分細胞做雄性特異性Sry基因鑒定。

1.4 雄性特異性Sry基因檢測PCR引物：Sry上游:5'-CAG CTA ACA CTG ATC TTT TC-3'，下游：5'-TTA CTG AGC CAG AAT CAT AG-3'；β-actin上游：5'-TGT ACG TAG CCA TCC AGG C-3'，下游：5'-TTC TCC AGG GAG GAA GAG GA-3'，由大連寶生物公司合成。PCR反應條件如下：94℃孵育3min；35個循環(94℃30 s，50℃30 s，72℃2.5 min)，最后在72℃延伸5min。

1.5 樹鼩臍帶MSC輸注給D-gal連續注射誘導衰老成功的雌性樹鼩，尾靜脈輸注雄性臍帶MSC的單細胞懸液，106個細胞/只，1次/2 w，共2次。

1.6 檢測指標分別在注射D-gal前和注射后第9 w時，通過尾靜脈采集外周血3 ml，室溫下放置4 h后，離心，收集血清，-20℃保存備用，分別檢測下述指標，按照試劑盒說明進行操作。

1.6.1 SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，用752紫外分光度計550 nm波長處檢測，根據抑制率的高低計算SOD的含量。

1.6.2 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，用752紫外分光度計532 nm波長處檢測。

1.6.3 GSH-PX活性采用化學比色法，用752紫外分光度計在412 nm處檢測。

1.7 統計學方法采用SPSS13.0統計軟件分析，計量數據用±s表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D-gal誘導樹鼩出現衰老特征的代謝改變連續8 w給樹鼩皮下注射D-gal后，樹鼩表現為：體重減少，血清中SOD及GSH-PX活性下降，而MDA含量升高(P＜0.05，表1）。

2.2 臍帶MSC輸注干預后樹鼩代謝障礙得到改善

D-gal誘導衰老樹鼩輸注臍帶MSC 6 w后，體重逐漸上升，血清SOD及GSH-PX活性逐漸恢復，而MDA含量降低(P＜0.05，表1）。取MSC處理后的樹鼩肝組織，提取核酸，PCR擴增Syr基因，瓊脂糖電泳，可見明顯的條帶，證明有來自雄性供體的細胞。

3 討論

血液中的SOD和GSH-PX活性隨動物年齡的增長而降低，它們是反映機體衰老和氧化應激水平的重要指標。本研究通過給青年樹鼩連續注射D-gal，8 w后，實驗樹鼩出現體重減少，血漿SOD及GSH-PX活性下降，MDA含量升高，動物表現出機體抗氧化能力減弱和代謝紊亂的特征，與嚙齒類動物衰老模型表現基本一致。給衰老樹鼩輸注MSC進行干預6 w后，樹鼩血清SOD及GSH-PX活性得到逐漸恢復，而MDA則含量逐漸降低。提示適當補充MSC，可對機體SOD和GSH-PX的活性產生影響，對衰老樹鼩的代謝具有改善作用。非人靈長類動物（如獼猴和黑猩猩）具遺傳學上最接近人類的優勢，用其建立的衰老模型在特征和發生機制方面能夠較全面地反映人類衰老基本情況，但是它們價格昂貴且不易獲取。樹鼩與靈長類親緣關系最為接近，本研究結果表明，通過注射D-gal，可以誘導樹鼩發生衰老的代謝改變，我們認為用其代替非人靈長類動物作為新型實驗動物模型，具有可行性，在未來衰老和抗衰老的研究中，樹鼩衰老模型有著良好的應用前景。

[1]張常娥，魏偉，劉英華,等.D-半乳糖亞急性衰老大鼠模型的建立及評價[J].中國老年學雜志,2012，32(4):742-745.

表1 D-gal誘導樹韻衰老和MCS干預后血槳SOD、GSH-PX活性和MDA含量的變化

[2]Fan Y,Huang ZY,Cao CC，et al.Genome of the Chinese tree shrew[J]，Nature Communications,2013,4，Article number:1426.

[3]Baksh D,Yao R,Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of humanmesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow[J],Stem Cells，2007，25(6):1384-1392.

[4]Covas DT,Siufi JL,Silva AR,et al.Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells[J],Braz JMed Biol Res, 2003，36(9):1179-1183.

Effects of umbilical cordmesenchymal stem cells onmetabolism of aging tree shrewmodel

Tao Jian1,2,Pan Xinghua1,Wang Jinxiang1,Yang Jianyong11.Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;2.Medical School of Kunming University,Yunnan,Kunming,650214,China

Objective To establish the agingmodel throughmetabolic disorder of tree shrew induced by continuous injection with D-galactose,and to evaluate the effects of umbilical cord mesenchymal stem cell infusion on the metabolism of aging tree shrew.Methods Twelve female tree shrews were divided into blank group(two)and modeling group(ten).The modeling group

subcutaneous injection in the nape with 10%D-galactose 2.5ml/(100 g·d).The blank group received the subcutaneous injection with the same volume of water.After continuous 8 weeks,detection wasmade in the content changes of SOD,GSH-PX,and MDA in the peripheral blood of both groups.After the establishmentof aging tree shrewmodel,themale tree shrews received twice the intravenous injection via the tailswith umbilical cordmesenchymal stem cells.Twoweeks later,detection wasmade in the SOD,GSH-PX,and MDA contents in the peripheral blood.Results After injection with D-galactose for continuous 8 weeks,the weight ofmodeling tree shrews decreased.The activity ofblood plasma SOD and GSH-PX decreased,and the content of MDA significantly increased(P＜0.05).After the injection with umbilical cordmesenchymal stem cells,the tree shrews'serum SOD and GSH-PX activity increased,and the content ofMDA significantly decreased(P＜0.05).Conclusion Continuous injection with D-galactose can induce the distinctive agingmetabolic changes in tree shrews.The infusion with umbilical cordmesenchymal stem cells can improve themetabolism ofaging tree shrews.

D-galactose;aging;tree shrew;umbilical cord;mesenchymal stem cell

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0832-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.007

2015-03-26）

國家科技支撐計劃（2014BI01B0）；國家自然科學基金(31172170)；云南省科技計劃重點項目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心，云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，成都軍區昆明總醫院（陶劍,潘興華，王金祥，楊建勇）；昆明醫學院（陶劍）

潘興華，E-mail:xinghuapan@sohu.com.cn