NIX介導的細胞自噬在低氧誘導ATⅡ凋亡中的作用

黃一，王婷婷，游凱，張明燦

NIX介導的細胞自噬在低氧誘導ATⅡ凋亡中的作用

黃一，王婷婷，游凱，張明燦

目的探討NIX蛋白在低氧誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞（ATⅡ）凋亡中的作用。方法以自噬抑制劑和caspase抑制劑分別預處理人ATⅡ細胞株A549 1 h后，再低氧暴露24 h，Annexin V和碘化丙啶（PI）染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。為了分析NIX介導的自噬在低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡中的作用，以siRNA沉默NIX表達后，觀察低氧暴露后細胞自噬水平的變化（MDC染色觀察自噬溶酶體數量、Western blot檢測自噬相關蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ的表達變化）以及凋亡的變化。結果低氧誘導的細胞凋亡分別被自噬抑制劑和caspase抑制劑減弱；低氧暴露促進NIX表達并上調細胞自噬水平；沉默NIX能下調細胞自噬水平，減少低氧誘導的細胞凋亡，且作用可被caspase抑制劑減弱，而不被自噬抑制劑減弱。結論低氧暴露引起NIX蛋白表達而導致其介導的細胞自噬增加，這可能是低氧誘導ATⅡ細胞非caspase依賴性凋亡的機制之一。

肺泡；Ⅱ型上皮細胞；NIX；自噬；凋亡

低氧是急性肺損傷發生和發展的中心環節。肺泡上皮細胞最早暴露于低氧環境，易發生結構和功能損害。越來越多的證據表明，缺氧誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞（ATⅡ）凋亡在急性肺損傷中具有重要作用，但是目前對低氧誘導ATⅡ凋亡機制并未闡明。雖然目前認為caspase依賴的Fas/Fasl系統介導的凋亡為主要途徑，但還有研究發現存在有NIX蛋白參與的非caspase依賴性的凋亡通路[1]。NIX蛋白與細胞自噬密切相關，并且我們前期研究發現，缺氧導致肺組織NIX蛋白表達明顯增高，并且與ATⅡ細胞凋亡呈顯著性正相關，但是其分子機制尚不明確。因此，本研究以低氧誘導人ATⅡ細胞株A549細胞凋亡，探討NIX蛋白在低氧誘導ATⅡ凋亡中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 肺泡上皮細胞培養及缺氧處理人肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549，ATCC，美國)以RPMI1640培養基+ 10%FBS常規培養，將細胞分為常氧組、低氧組、低氧組+自噬抑制劑組、低氧+caspase抑制劑組。常氧組細胞置常規培養箱內(95%空氣，5%CO2，37℃)培養24 h；低氧組細胞置低氧培養箱內(1%O2，5% CO2，37℃)培養24 h；低氧組+自噬抑制劑組和低氧+caspase抑制劑組細胞，在低氧暴露前1 h分別將自噬抑制劑3-Methyladenine（3-MA，5 mM，Sigma，美國）和caspase抑制劑Z-VAD-FMK（20μM，碧云天，中國）加入到培養液中，之后再將細胞置于低氧培養箱內培養。

1.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡收集上述各組懸浮和貼壁細胞至離心管，離心后用預冷PBS重懸細胞，取5~10萬個重懸細胞，1000 g離心5min，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結合液再次重懸細胞后，加入5μl Annexin V-FITC，混勻后再加入10μl PI染色液，室溫避光孵育20min后置于冰浴中，使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天，中國）檢測細胞凋亡，操作按說明進行。

1.3 MDC染色常氧組和低氧組細胞分別給予MDC（20μM，Sigma，美國）加入到培養液中，對照組給予等量載體溶劑（甲醇），孵育45 min后，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 NIX基因沉默裝載NIX siRNA的腺病毒載體由廣州銳博生物技術公司制備。siRNA序列為：F:5＇-AACAGUUCCUGGGUGGAGCUA-3＇;R 5＇-AA-CA CGUACCAUCCUCAUCCU-3＇。將病毒液加入細胞培養上清中感染細胞，4 h后更換新鮮RPMI1640+ 10%FBS培養液，12 h后可以看見綠色熒光。之后提取細胞總RNA和蛋白，以qRT-PCR和Western blot方法分別檢測siRNA對NIX mRNA和蛋白水平的抑制效率。

1.5 Western blot分析RIPA裂解液（按1∶100添加PMSF）裂解細胞提取總蛋白，離心后取上清，BCA法測蛋白濃度。添加SDS上樣緩沖液后，95℃變性5min，取20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，分別加入特異性抗體Beclin-1（1∶200，Santa，美國）、LC3Ⅱ（1∶200，Santa）、NIX（1∶500，Santa）、β-actin（1∶1000，碧云天，中國）于4℃過夜，漂洗后與HRP標記的IgG抗體37℃孵育1 h，以ECL試劑盒行放射自顯影，Quantity One軟件分析條帶吸光度值。

2 結果

2.1 自噬抑制劑和凋亡抑制劑均可減輕低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡分別以自噬抑制劑3-Methyladenine、凋亡抑制劑Z-VAD-FMK預處理細胞1 h后，再低氧暴露24 h，Annexin V和PI染色檢測細胞凋亡結果顯示，低氧能夠顯著誘導ATⅡ細胞凋亡，而3-Methyladenine和Z-VAD-FMK均可減輕低氧誘導的細胞凋亡(圖1），提示在低氧誘導的ATⅡ凋亡，不僅由caspase介導，還可以通過自噬介導。

2.2 低氧促進ATⅡ細胞NIX表達及自噬水平增加低氧暴露24 h后，ATⅡ細胞中NIX蛋白表達水平較對照組顯著增加（圖2A），自噬相關蛋白beclin-1和LC3Ⅱ的表達顯著增加（圖2B、2C），并且細胞內自噬溶酶體數量較對照組顯著增加(圖2D)。

2.3 抑制NIX表達能減弱低氧誘導的細胞自噬水平增加構建以NIX為靶點的siNRA腺病毒載體并轉染細胞，結果顯示能有效抑制NIX表達（圖3A）。且在低氧誘導后，siRNA組和對照組細胞自噬水平均較常氧條件下有所增加，但siRNA組細胞的增加幅度顯著低于陰性對照組和空白對照組細胞，提示NIX參與調節低于氧誘導的細胞自噬（圖3B-D）。

圖1 自噬抑制劑和凋亡抑制劑均可減輕低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡

圖2 低氧促進ATⅡ細胞NIX表達并上調自噬水平

2.4 抑制NIX表達能減輕低氧誘導的細胞凋亡

分別以自噬抑制劑和caspase抑制劑預處理細胞1 h再低氧暴露24 h，流式檢測細胞凋亡，結果顯示沉默NIX后，低氧誘導的細胞凋亡顯著低于對照組，并且3-Methyladenine能顯著減少低氧誘導的細胞死亡，但Z-VAD-FMK對低氧誘導的細胞死亡作用不明顯，提示NIX介導的自噬參與低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡（圖4）。

圖3 抑制NIX表達能減輕低氧誘導的細胞自噬

圖4 抑制NIX表達能減輕低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡

3 討論

本研究結果發現：（1）低氧暴露促進NIX表達并上調細胞自噬水平；（2）低氧誘導的細胞凋亡不僅由caspase介導，還由自噬介導；（3）沉默NIX能下調細胞自噬水平，減少低氧誘導的細胞凋亡，其作用可被caspase抑制劑減弱，而不被自噬抑制劑減弱。以上結果提示，在低氧暴露后，ATⅡ細胞中NIX蛋白表達上調引起細胞自噬水平增加，這可能是低氧誘導ATⅡ細胞非caspase依賴性凋亡的機制之一。

低氧是急性肺損傷的主要致病因素，也是導致ATⅡ細胞凋亡的主要原因[2-4]。ATⅡ因具有自我增殖和分化的作用，而在肺泡上皮損傷修復中具有重要作用[5-6]。因此，抑制ATⅡ細胞凋亡，對缺氧等因素引起的急性肺損傷修復具有重要作用。

細胞程序性死亡除凋亡外，還包括自噬性死亡[7]。細胞自噬是細胞在饑餓等條件下，細胞內受損、變性或衰老的蛋白和細胞器被溶酶體消化降解，是體內普遍存在的生理過程，在清除代謝廢物轉而進行能量回收中有重要作用。但過度的細胞自噬會引起細胞凋亡。自噬以自噬體的出現為特征，不依賴蛋白水解酶的作用，與凋亡具有顯著區別。既往對急性肺損傷中ATⅡ細胞的凋亡主要集中于低氧暴露后引起caspase介導的細胞凋亡方面，但對自噬介導的ATⅡ細胞凋亡的報道減少。本研究發現，在低氧暴露后，細胞自噬水平顯著增加。另外，與caspase抑制劑相似，自噬抑制劑能顯著減弱低氧誘導的細胞凋亡，這說明低氧暴露誘導的ATⅡ細胞凋亡，除經典caspase凋亡途徑外，還包括自噬性介導的凋亡。

促凋亡蛋白NIX是一種線粒體外膜蛋白，也稱BNIP3L（Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3-like），是Bcl-2基因家族成員。其C末端含有一個跨膜區域可與線粒體膜結合，引起線粒體膜通透性轉換孔開放，膜電位降低，活性氧增加，誘發細胞死亡[8]。另外，新近研究顯示，NIX在調節細胞自噬中發揮重要作用[9]。我們前期研究發現，在急性肺損傷后，肺組織內NIX表達上調，并且與ATⅡ細胞的凋亡呈正相關。為了進一步探討NIX在低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡中的調節作用，本研究采用基因沉默技術抑制ATⅡ細胞NIX的表達。結果顯示，抑制NIX表達后，細胞自噬對低氧的敏感性降低，提示在低氧暴露后，ATⅡ細胞自噬水平的增加主要由NIX介導。目前，在誘導細胞死亡的過程中，關于自噬與凋亡的關系仍未完全闡明。普遍認為，自噬與凋亡可能保持著動態平衡。另外，在不同的環境因素下，自噬也有可能抑制凋亡，保護細胞；自噬還可能啟動凋亡，共同促進細胞死亡[10]。本研究觀察到，抑制NIX表達后，低氧誘導的ATⅡ細胞的自噬水平和凋亡比例較對照組顯著降低，說明NIX介導自噬參與低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡。為了進一步明確NIX介導的自噬在低氧誘導的ATⅡ細胞凋亡中是以何種途徑為主，本研究利用siRNA抑制NIX表達的細胞，分別給予自噬抑制劑和凋亡抑制劑預處理細胞，之后再將細胞暴露于低氧環境。結果顯示，抑制NIX表達后，低氧誘導的細胞凋亡能被凋亡抑制劑顯著抑制，但自噬抑制劑對此環節的抑制作用不明顯，提示在低氧暴露誘導的ATⅡ細胞凋亡中，NIX主要介導的是自噬性凋亡。

綜上所述，ATⅡ細胞在低氧環境下，NIX表達上調，其介導的細胞自噬水平增加，從而促進凋亡，這可能是低氧誘導ATⅡ細胞非caspase依賴性凋亡的機制之一。

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Effects of NIX mediated autophagy on hypoxia induced alveolar epithelial typeⅡcell apoptosis

Huang Yi,Wang Tingting,You Kai,Zhang Mingcan Departmentof Chest Surgery,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China

Objective To discuss the effects of NIX mediated autophagy on hypoxia induced alveolar epithelial typeⅡ(ATⅡ) cell apoptosis.Methods After pretreated respectively by autophagy inhibitor and caspase inhibitor for one hour,human ATⅡcell strain A549 then exposed in hypoxia for 24 hours and dyed by Annexin V and PI.The cell apoptosiswas detected by flow cytometry. In order to analyzed the effect of NIX mediated autophagy in hypoxia induced ATⅡcell apoptosis,siRNA was used to silence the expression of NIX,and then the changes in cell autophagy and apoptosis levels after the exposure to hypoxia were observed(MDC dyeingwas carried out to observe the lysosome amountof autophagy,and Western blot detection was carried out to test the changes in the expression of autophagy associated protein Beclin-1 and LC3Ⅱ).Results Hypoxia induced cell apoptosis was weakened by autophagy inhibitor and caspase inhibitor.Hypoxic exposure promoted NIX expression and increased the cell autophagy level.The silencing of NIX decreased autophagy level and hypoxia induced cell apoptosis,and its effect could be weakened by caspase inhibitor but not by autophagy inhibitor.Conclusion Hypoxic exposure results in the expression of NIX protein and increases NIX mediated autophagy,whichmay be one of themechanisms of hypoxia induced ATⅡcell caspase non-dependentapoptosis.

pulmonary alveolus;epithelial typeⅡcell;NIX;autophagy;apoptosis

R 563.9/364.4

A

1004-0188（2015）08-0847-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.012

2015-05-18）

重慶市衛生局醫學科研項目（2013-2-306）

400020重慶，解放軍324醫院胸外科

張明燦，電話：023-68762060；E-mail:zhangmc324@sina. com